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1、NK細胞對乳腺癌細胞株體外殺傷作用摘要目的：探尋經免疫磁珠分選純化的原代NK細胞體外長期培養(yǎng)、大量增殖的條件；研究HLA半相合的異基因NK細胞對實體瘤乳腺癌細胞株的體外殺傷作用，以及NK細胞表面的NKG2D受體及其相對應的、表達于腫瘤細胞表面的MIC配體的表達水平與該腫瘤細胞對NK細胞殺傷敏感性之間的關系。方法：1，取健康成年人外周血lOml，F(xiàn)icoll法分離獲取單個核細胞，培養(yǎng)于6孔板，貼壁法去除單核細胞。使用德國美天旎公司MACS系統(tǒng)，CD56+Microbeads免疫磁珠分選試劑盒提取高純度NK細胞。2．將EB病毒株B95—8細胞常規(guī)培養(yǎng)14天
2、，分別于第7天和第14天收集培養(yǎng)上清。將PBMCs與此含有病毒的上清共培養(yǎng)，并加入環(huán)孢索A(CyA)，至三者的終濃度為：PBMCs為1X106／ml，EB病毒為20％，CyA為20¨g／ml，培養(yǎng)于96孔板，根據細胞生長情況每3-4天換液一次，4周后收獲EB病毒轉化的B淋巴母細胞樣細胞(EBV—LCLs)，作為NK長期培養(yǎng)的飼養(yǎng)細胞。以經照射EBV—LCLs作為飼細胞，在含有IL一15(100u／mL)和中濃度分別為lOOu／mL和500u／mLIL～2的SCGM(stemcellgrowthmedium)q1長期培養(yǎng)NK細胞。3．取瘤細胞或者NK細胞
3、約105個，堿裂解法抽提DNA，SSP—PCR方法檢測腫瘤細胞HLA—Cw位點和NK細胞KIR位點表達，根據檢測結果，分別將二者分為Gl組和G2組(G1組的HLA～C位點為HLA—Cw2、4、5、6，KIR位點為2DL2／2DL3和2DS2／2DS3)G2組的HLA—C位點為HLA—Cwl、3、7、8，KIR位點為KIR2DLl／2DSl)。4．MTT法檢測HLA—Cw相合與不相合組的NK細胞對實體瘤細胞的殺傷率，以對NK細胞敏感的紅白血病細胞株K562作為對照組。5．RT—PCR方法檢測NK細胞表達NKG2D水平，了解其在與腫瘤細胞共培養(yǎng)前后表達水平
4、的變化，以及乳腺癌細胞表達MICA水平與NK細胞對乳腺癌細胞的殺傷率的關系。結果：1．MAC$系統(tǒng)分選出的NK細胞，經流式細胞儀檢測，CD3‘CD56+細胞的比例(91，1±7．4)％。使用EBV～LCLs作為飼養(yǎng)細胞，在含1L一2的干細胞培養(yǎng)液(SCGM)中培養(yǎng)NK細胞，比較了培養(yǎng)2周、3周、4周的NK細胞，其殺傷活力與新鮮分離的NK細胞相比并無顯著下降；不同濃度IL一2對NK細胞增殖d的影響并無顯著的統(tǒng)計學意義。2．KIR／HLA—Cw相合組的NK細胞對乳腺癌細胞株的殺傷率明顯高于KIR／HLA—Cw不相合組，兩組比較差異具有顯著性(p<0．05)
5、。乳腺癌細胞表面MICA的表達水平較高的時候，則NK細胞對其的殺傷率也較高。結論：1．使用飼養(yǎng)細胞EBV—LCLs培養(yǎng)原代NK細胞，可進行體外長期培養(yǎng)，細胞活力不下降。2．NK細胞的KIR位點與實體瘤細胞的HLA-Cw位點相合組，NK細胞對瘤細胞的殺傷率明顯高于HLA不相合組。3．腫瘤細胞表面表達的MIC分子水平和它對NK細胞的敏感性有關，腫瘤細胞表面的MICA分子可上調NK細胞表面NKG2D的表達，激發(fā)NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒效應。關鍵詞：腫瘤免疫乳腺癌NK細胞KIRNKG2MIC過繼免疫實體瘤生物治療原代培養(yǎng)體外增殖擴增Effectsofnatu
6、ralkillercellsonkillingbreastcancercelllinesinvitroAbstractObjectiveToinvestigatethemostoptimalconditionsofculturingandproliferationofNKcellspurifiedfromPBMCsbynegativedepletionusingimmumomagneticmicrobeads；andtOinvestigatetherelationsbetweenKIRonNKcellsandHLA-Cwonthetumorcells，
7、whetherbreastcancercelllineswouldhaveenhancedsusceptibilitytoallogeneticKIR—incompatibleNKcellscomparedwiththeirKIR·-matchedallo--geneticcounterpartstoinvestigatetherelationsbetweenNKG2onNKcellsandMIContumorcellswiththekillingactivityofNKcells．Toanalysetherelationshipbetweenthee
8、xpressionlevelofMIContumorcellsurfacesandthespe
