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《扁吻魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記篩選、群體分析及東北雅羅魚腎組織鹽堿差異表達(dá)候選基因篩選》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:我恪守學(xué)術(shù)道德,崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文,是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下,獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外,本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫,我對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé),并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名:日期:年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,允
2、許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□,在年解密后適用本版權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名:指導(dǎo)教師簽名:日期:年月日日期:年月日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯委員會(huì)成員名單姓名工作單位職稱備注答辯地點(diǎn)答辯日期上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文扁吻魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選、群體分析及東北雅羅魚腎組織鹽堿差異表達(dá)候選基因的篩選摘要通過磁珠富集法篩選扁吻魚(Aspiorhynchusla
3、ticepsDay)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。采用限制性內(nèi)切酶Sau3AI對扁吻魚基因組DNA進(jìn)行酶切,選取250~750bp的片段進(jìn)行PCR全基因組擴(kuò)增,并利用生物素標(biāo)記的(CA)8探針進(jìn)行微衛(wèi)星片段的富集。將得到的片段連接T載體后轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌中,采用菌落PCR法篩選陽性克隆,最后挑取擴(kuò)增片段大小在250~750bp之間的192個(gè)克隆菌落送生物公司測序。測序結(jié)果顯示,含微衛(wèi)星序列的克隆有53個(gè)。經(jīng)統(tǒng)計(jì),在這53個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中完美型共36個(gè),占67.92%;非完美型12個(gè),占22.64%;混合型5個(gè)
4、,占9.43%。選取側(cè)翼序列符合引物設(shè)計(jì)條件的微衛(wèi)星序列50個(gè),結(jié)果成功設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物25對。引物篩選發(fā)現(xiàn),24對引物可擴(kuò)增出清晰條帶,其中13對引物具有多態(tài)性。結(jié)果顯示等位基因數(shù)在2~6,多態(tài)信息含量為0.2237~0.7445,PIC平均值為0.5353,12個(gè)(92%)位點(diǎn)表現(xiàn)出高度的多態(tài)性(PIC>0.5),1個(gè)(8%)位點(diǎn)表現(xiàn)出中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5)。觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的平均值分別為0.5567和0.6893。同時(shí)隨機(jī)抽取1000對鯉魚引物檢測扁吻魚同源位
5、點(diǎn)的多態(tài)性,獲得具多態(tài)性位點(diǎn)18對。采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法,利用31個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記對扁吻魚及塔里木裂腹魚的野生群體進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期對其種質(zhì)資源進(jìn)行有目的保護(hù),為遺傳育種等提供理論依據(jù)。共檢測了扁吻魚1個(gè)野生群體,24個(gè)個(gè)體,塔里木裂腹魚1個(gè)野生群體,19個(gè)個(gè)體,2個(gè)群體的平均等位基因數(shù)A為7.78~11.65,平均有效等位基因數(shù)為Ne為4.91~6.81,平均觀察雜合度Ho為0.6043~0.7077,平均期望雜合度He為0.7618~0.8313,平均多態(tài)信息含量PIC為0.7174~
6、0.7970。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,扁吻魚與尖嘴臀鱗魚群體之間遺傳相似系數(shù)I=0.6211(遺傳距離DS=0.4763),平均遺傳分化系數(shù)為0.1564,表明2個(gè)群體間存在明顯的遺傳分化,與分類學(xué)研究一致,屬于同科不同屬的種群。為從基因表達(dá)水平上研究魚類耐鹽堿機(jī)制,選取東北地區(qū)具有耐鹽堿性狀的東北雅羅魚(LeuciscuswaleckiiDybowski)為實(shí)驗(yàn)材料,采用相對實(shí)時(shí)熒光定量I上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文PCR法進(jìn)行基因表達(dá)量差異檢測。鑒于在堿度發(fā)生變化的過程中,鰓、腎是參與滲透壓調(diào)節(jié)的重要組織,其
7、中的基因表達(dá)變化通常是最快、最靈敏的。通過查閱文獻(xiàn),根據(jù)梁利群等對雅羅魚與斑馬魚芯片比對的結(jié)果,查閱動(dòng)、植物耐鹽堿相關(guān)的文獻(xiàn),挑選了11個(gè)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜通道蛋白基因,共設(shè)計(jì)引物17對。根據(jù)熒光定量RT-PCR的擴(kuò)增特點(diǎn)和要求,所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增片段大小應(yīng)在100~200bp之間。內(nèi)參基因的引物序列參照李勇等報(bào)道的18SrRNA序列。隨機(jī)分成兩組,淡水對照組和鹽堿待測組,每組19尾,兩組魚同時(shí)處理30d;30d內(nèi)淡水對照組鹽堿度維持不變,待測組25d內(nèi)鹽堿度升至40,維持5d。30d后同時(shí)采樣,采集
8、雅羅魚鰓、腎組織提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨機(jī)挑選2個(gè)模板用普通PCR法對17對引物進(jìn)行篩選,結(jié)果有2個(gè)候選基因及內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增條帶清晰、唯一。采用相對定量方法,使用AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem檢測對照組和待測組各基因的實(shí)時(shí)表達(dá)量。用2-△△Ct法對結(jié)果進(jìn)行分析,以18SrRNA為內(nèi)參基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),達(dá)里湖雅羅魚的鰓組織中,鹽堿組的V-ATPASE表達(dá)量比對照組高出1.97倍,clica表達(dá)量比對照組高出2.2