豬pspⅱ蛋白基因調(diào)控序列的克隆及副性腺特異表達(dá)載體的建立

《豬pspⅱ蛋白基因調(diào)控序列的克隆及副性腺特異表達(dá)載體的建立》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、滕尚輝豬PSP-II基因調(diào)控序列的克隆及副性腺特異表達(dá)載體的建立豬PSP-II蛋白基因調(diào)控序列的克隆及副性腺特異表達(dá)載體的建立摘要：PSP．II是公豬精漿中含量較高的蛋白，且在豬副性腺特異表達(dá)并分泌到精液中，為了建立豬副性腺特異表達(dá)載體，根據(jù)已發(fā)表的PSP．II5’和3’．調(diào)控區(qū)序列設(shè)計(jì)兩對引物并引入酶切位點(diǎn)，用高保真PCR擴(kuò)增了豬PSP．II蛋白基因的5’端和3’端的調(diào)控元件及啟動子，長度分別約為4．1kb和3．1kb，并將PSP．II5’和3’．調(diào)控區(qū)序列分別克隆到pMDl8．TVector上，將

2、插入目的片段重組質(zhì)粒送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果Blast程序與已發(fā)表的序列的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比對，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增的PSP．II5’端和3’端調(diào)控區(qū)前500bp與已發(fā)表的序列的同源性為99．8％、100％。為了建立豬附性腺暫態(tài)生物反應(yīng)器，我們將已經(jīng)克隆的PSP．II基因5’端和3’端調(diào)控序列，應(yīng)用體外DNA重組技術(shù)連接到改造過的pcDNA3．0上，經(jīng)鑒定將正確的目的克隆命名為pC，然后將報(bào)告基因EGFP插入pC載體的PSP．II5’側(cè)翼區(qū)下游和3’側(cè)翼區(qū)上游。為確定建立的載體是否表達(dá)及

3、表達(dá)的特異性，將pC-EGFP質(zhì)粒及陽性對照pEGFP-N1質(zhì)粒分別經(jīng)PEI包裹手術(shù)轉(zhuǎn)染ICR小鼠精囊腺，轉(zhuǎn)染48h后，取小鼠精囊腺并提取mRNA用RT-PCR方法和做冰凍切片用熒光顯微鏡檢測熒光蛋白基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明pC-EGFP質(zhì)?？梢则?qū)動EGFP基因的表達(dá)。為確定表達(dá)的特異性，將pC-EGFP質(zhì)粒經(jīng)PEI包裹尾靜脈全身轉(zhuǎn)染ICR小鼠，轉(zhuǎn)染48h后，取精囊腺、肝臟、心臟、肺和肌肉提mRNA和做冰凍切片，用RT．PCR方法和熒光顯微鏡檢測各組織熒光蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明pC．EGFP真核表達(dá)

4、載體具有很好的組織特異性。從而確定首次成功建立了豬附性腺特異表達(dá)熒光蛋白的載體。該載體的建立為豬附性腺高效表達(dá)技術(shù)體系深入研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬副性腺特異表達(dá)載體；PSP．II；基因克隆；基因表達(dá)8貴州大學(xué)碩士論文CloningofflankingregionofpigPSP一1IgeneandconstructionofAccessorySexGlandspecificexpressionvectorTeng—-shanghuiAbstract：Amongalloftheboarspermadh

5、esinproteins，PSP．Ⅱisamajorcomponentofboarseminalplasma,whichisaspecmcsecretaryproductofaccessorysexgland．InordertoconstructaccessorySeXglandspecificexpressionvectors，weclonedthesequencesof5’·and3'-flankingregionofPSP-IIbyPCRtechnology,accordingtothepubl

6、ishedsequenceofPSP—II，andthelengthofclonedsequencesisabout4．1kband3．1kb．ThetwoclonedfragmentswereinsertedintoPmdl8．TvectorandsequencedbyShallghaiGeneCoreBioTechnologiesCo．，Ltd．subsequently．ThesequencesweTeanalysisbyBlastprocess，theresultisthatthehomolog

7、ywas99．8％，100％offrist500bpofthe5’-and3'-flankingregionofPSP．II，indicatedthatthesequenceweclonedwascorrectly．Inordertoconstructaccessorysexglandbioreactor,the5'-and3'-flankingregionofPSP-11wereclonedandinsertedintomodifiedpcDNA3．0andformedtheaccessorysex

8、glandspecificexpressionvectorofEGFPgene．Totesttheexpressioncharacteroftheaccessorysexglandspecificexpressionvector,therecombinatvectorofPC-EGFPandthecontrolpEGFP-N1vectorweretransfectedwiththe10Reseminalvesicledirectlybyinjection