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1、精原干細胞移植治療不育大鼠的研究研究生李松導(dǎo)師張衛(wèi)星教授王瑞教授鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科河南鄭州450052摘要研究背景及目的男性不育的診斷與治療是男科學(xué)領(lǐng)域的一個難題，目前，男性不育的診療水平遠遠不能滿足廣大不育患者的要求，且不育癥的發(fā)病率呈現(xiàn)升高的趨勢。近年來，隨著精原干細胞移植技術(shù)的發(fā)展，將為這一難題探索出一種新的治療方法。精原干細胞(sscs)是哺乳動物成體皋丸生精上皮內(nèi)唯一可復(fù)制的多潛能二倍體細胞，它能在體外分離、純化、培養(yǎng)、凍存及同體或異體移植。1994年，Brinster實驗室l’】首次報道了sscs移植，并證明它在運用于干細胞以及支持細胞、生殖細胞相互關(guān)
2、系的研究中是一項技術(shù)性的突破。運用該技術(shù)不僅能將SSCs從一個動物成功移植到另一個同種屬動物體內(nèi)(同種基因移植)，而且也能移植到不同種屬動物體內(nèi)(異種基因移植)。伴隨精原干細胞群的分離培養(yǎng)、富集和凍存的發(fā)展及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的運用，SSCs移植將為治療雄性不育、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物及為不育患者選擇基因治療提供一條新的途徑[2]。這項技術(shù)將應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)、人文醫(yī)學(xué)和家畜及野生動物繁殖。精原干細胞具有永生化和多能化潛能，是精子形成的前體細胞，在翠丸微環(huán)境中具有增殖和分化的能力。精原干細胞移植為男性不育癥的治療開啟了一扇新的大門。本實驗中，我們通過比較不同的受體動物處理方法，探索用于精原干細
3、胞移植的受體動物的合適的造模方法，另外探索精原干細胞分離純化的方法和同種異體精原干細胞的移植方法，并對移植效果做出評價，通過動物實驗為將來的臨床應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。方法一探討合適的造模方法將s一n大鼠隨機分為7組，每組10只，分別采用鉆609oy、8oy、7oy、6oy、6Gy劑量間隔一周照射兩次、白消安40tn叭g單次腹腔注射組，另外一組為正常對照組。觀察干預(yù)后三個月的死亡率，分別于干預(yù)后一月、三月取大鼠的辜丸做病理。通過死亡率和辜丸病理情況判斷不同劑量鉆60照射以及白消安腹腔注射的造模效果，為后續(xù)的精原干細胞移植提供合適的受體動物模型。二建立用于移植的不育動物模型取
4、8周齡的s一D大鼠15只，體重200士209，以鉆606Gy劑量做全身照射，一周后相同劑量再次全身照射，四周后予以移植。三分離培養(yǎng)精原干細胞取9一10日齡的S一D大鼠的翠丸，采用機械法+兩步酶消化法+差速貼壁法提取精原干細胞。斷頸法處死大鼠，無菌收集雙側(cè)翠丸，置于盛有HBSS的圓盤中，仔細剝除脂肪墊、附攀、皋丸被膜，并以HBSS反復(fù)輕緩吹打。將辜丸組織轉(zhuǎn)移至特制小器皿中，皿內(nèi)盛少量HBSS，用眼科剪將組織剪至粉末狀，將粉末狀組織轉(zhuǎn)移至已放置攪拌器的青霉素瓶中。加入相當于組織ro倍體積的lm留InlW型膠原酶溶液，在37℃消化15min，并在磁力攪拌器上輕緩攪拌。靜置10In
5、in，吸出上清并棄之，向青霉素瓶內(nèi)加入含0.smg/in1DNasel功25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的復(fù)合酶溶液，在37℃消化10min，并在磁力攪拌器上輕緩攪拌。加入FBS終止胰蛋白酶消化，加入HBsS稀釋并輕緩吹打。將消化后的細胞懸液分別經(jīng)200目、400目的篩網(wǎng)過濾后，將細胞懸液收集在離心管內(nèi)，以l以X時min離心3min。棄上清，加入新鮮配制的完全培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為3xl護個樹。將細胞接種至用光學(xué)透明純聚苯乙烯制造的25crnZ細胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5%cq培養(yǎng)箱中孵育4h，收集尚未貼壁的懸浮細胞，以IO00r/min離心3min，加入培養(yǎng)液，重新調(diào)整細胞
6、密度為3xl護個/ml。四精原干細胞移植到受體動物受體動物選擇約8周齡，體重2009左右的s一D大鼠，采用鉆606Gy劑量間隔一周照射兩次，照射一個月后行精原干細胞移植。(l)大鼠稱重后，以10%水合氯醛按照3oom叭g(03mF100g)體重進行腹腔注射麻醉。(2)大鼠取仰臥位，消毒下腹會陰區(qū)，取陰囊正中切口長約Zcln，切開陰囊各層，將兩側(cè)辜丸拉出陰囊置于紗布上。(3)參照文獻方法13]，用lml注射器穿刺一側(cè)辜丸網(wǎng)，注入精原干細胞懸液，另一側(cè)肇丸作自身對照。移植后清潔開放環(huán)境中飼養(yǎng)。五移植效果的評價于移植后2個月，切取翠丸，用Bouln，s液(飽和苦味酸水溶液75ml
7、、福爾馬林25ml、冰醋酸5ml)固定24h。行蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察移植組肇丸和對照組皋丸的病理學(xué)表現(xiàn)，免疫組化SABC法檢測。一t的表達。結(jié)果一gGy組于放射后巧天內(nèi)全部死亡，死亡率為100%;SGy組三個月內(nèi)死亡4只，死亡率為40%，肇丸大小與對照組相比明顯減小，翠丸各級生精細胞明顯減少;7Gy、6Gy組三個月內(nèi)各死亡兩只，死亡率20%，兩組翠丸大小與對照組相比無明顯差異，僅見部分生精細胞層次減少，部分細胞排列紊亂;6Gy間隔一周照射兩次組分別于照射后5天15天各死亡一只，死亡率20%，辜丸大小與對照組相
