資源描述：
《精原干細胞體外基因轉(zhuǎn)染及其移植的初步研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、陳芳：精原干細胞體外基因轉(zhuǎn)染及其移植的初步研究I精原干細胞體外基因轉(zhuǎn)染及其移植的初步研究摘要背景和目的：精原干細胞(spermatogonialstemcells，SSCs)具有自我更新的能力，是雄性動物體內(nèi)唯一能將遺傳信息傳遞給后代的干細胞。因此，SSCs將會為干細胞生物學、雄性不育治療、瀕危動物保護、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家畜培育等研究提供一種新的強有力工具。自1994年Brinster首次建立SSCs移植技術(shù)以來，運用這一技術(shù)，亦有轉(zhuǎn)基因動物的問世。SSCs移植技術(shù)在羊、牛、豬、雞等動物上取得了較大的進展。然而，由于犬生殖生理及雌性配子結(jié)構(gòu)的特殊性，以傳統(tǒng)
2、的原核顯微注射法，人類至今未能獲得轉(zhuǎn)基因犬；同時，也未見有通過SSCs分離、體外基因轉(zhuǎn)染及移植的方法來制備轉(zhuǎn)基因犬的相關(guān)報道。本研究以小鼠為模型，開展SSCs分離、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及移植的研究，在此基礎(chǔ)上，對犬SSCs的分離、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、移植及無精子癥犬模型構(gòu)建做了探索性的研究，為利用轉(zhuǎn)基因SSCs移植法制備轉(zhuǎn)基因犬奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。研究內(nèi)容與方法：①實驗動物：用作SSCs分離的動物，分別選擇7．8日齡的ICR公鼠，4-4．5月齡的公犬。②SSCs的分離：采用0．29／L膠原酶．0．25％胰蛋白酶的復(fù)合酶消化法制備單細胞懸液。③SSCs的純化和培養(yǎng)：以差速貼壁法純化
3、SSCs，將純化后的SSCs接種培養(yǎng)于支持細胞飼養(yǎng)層上，并DMEM+IO％胎牛血清+l％谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％雙抗+1％丙酮酸鈉為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)。@SSCs的體外基因轉(zhuǎn)染：以綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為外源基因，采用陽離子聚合物法(含血清體系和無血清體系)和磷酸鈣法轉(zhuǎn)染SSCs，比較轉(zhuǎn)染后EGFP的表達情況。⑤無精子癥動物模型的構(gòu)建：小鼠采用腹腔注射不同濃度白消安(20mg／kg、40mg／kg、60mg／kg)的方法篩選消除內(nèi)源性SSCs的合適濃度；犬采用肌肉注射不同濃度白消安(8mg／kg、12mg／kg、15mg／kg)的方法篩選消除內(nèi)源性SS
4、Cs的合適濃度。⑥轉(zhuǎn)EGFP基因SSCs的移植：將轉(zhuǎn)染EGFP基因的SSCs移植到白消安消除其內(nèi)源性生精上皮的受體小鼠／犬睪丸內(nèi)，并于移植后不同時間段分別切取受體鼠和犬的睪丸，制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察表達情況。并對受體睪丸基因組DNA進行PCR擴增檢測。揚州大學碩士學位論文II結(jié)果：QSSCs的分離、純化和培養(yǎng)：7．8日齡是用于小鼠SSCs分離的最佳年齡段，4—4．5月齡是用于犬SSCs分離研究的最佳年齡段；采用0．29／L膠原酶．0．25％胰蛋白酶復(fù)合酶消化法消化生精上皮，小鼠和犬SSCs活率分別達至1J97．73％和95．81％；所獲得的SSCs經(jīng)差速
5、貼壁法純化后純化率為60．78％(小鼠)和50．86％(犬)；將純化后的SSCs培養(yǎng)于支持細胞飼養(yǎng)層上，SSCs貼壁時間為培養(yǎng)8h-12h，SSCs呈扁平圓形或卵圓形，大小均一，單個散在或多個成團、鏈狀存在。②SSCs的體外基因轉(zhuǎn)染：磷酸鈣法、陽離子聚合物法(含血清體系)和陽離子聚合物法(無血清體系)均可將外源EGFP基因?qū)隨SCs中，并能表達綠色熒光蛋白。磷酸鈣法對小鼠和犬SSCs的轉(zhuǎn)染率分別為8．12％和7．96％；陽離子聚合物法(含血清體系)對小鼠和犬SSCs的轉(zhuǎn)染率分別為22．14％和23．69％；陽離子聚合物法(無血清體系)對小鼠和犬SSCs的轉(zhuǎn)染率分
6、別為21．58％和24．01％。③白消安對內(nèi)源性SSCs的消除：根據(jù)動物的健康存活狀態(tài)及睪丸組織學結(jié)構(gòu)變化等，確定40mg／kg的注射劑量是消除小鼠內(nèi)源性SSCs的有效劑量；12mg／kg的注射劑量是消除犬內(nèi)源性生精細胞的有效劑量：④轉(zhuǎn)EGFP基因SSCs的移植結(jié)果：小鼠于移植后1w、2w和3w的睪丸冰凍切片上觀察到熒光，受體睪丸基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，擴增出]"620bp的特異性條帶；犬于移植后在冰凍切片上未見熒光，受體睪丸基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，未觀察到特異性條帶。結(jié)論：本實驗成功有效地分離培養(yǎng)了小鼠和犬的精原干細胞，在體外成功地將外源EGFP基因轉(zhuǎn)染
7、Nd,鼠和犬的SSCsl為，并將轉(zhuǎn)基因SSCs移植到無精子癥動物模型的睪丸內(nèi)，在移植后1w、2w和3w的小鼠睪丸冰凍切片上可見熒光，提示有EGFP基因的表達。上述實驗為為利用轉(zhuǎn)基因SSCs移植法制備轉(zhuǎn)基因犬奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：小鼠；犬；精原干細胞：基因轉(zhuǎn)染；移植；無精子癥模型陳芳：精原干細胞體外基因轉(zhuǎn)染及其移植的初步研究IIIFundamentalReserchonGeneTransferinV衙oandTransplantationofSpermatogonialStemCellsAbstractBackgroundandPurpose：Spermat
8、ogoni
