toll樣受體4在牙髓組織和成牙本質細胞中的表達和意義

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1、Toll樣受體4在牙髓組織和成牙本質細胞中的表達和意義中山大學博士學位論文Toll樣受體4在牙髓組織和成牙本質細胞中的表達和意義專業(yè)：博士生：口腔臨床醫(yī)學蔣宏偉指導教師：凌均柴教授中文摘要整齊排列在牙髓牙本質復合體最外層的成牙本質細胞是牙髓內首先接觸外來病原微生物刺激的細胞，近年來的研究發(fā)現成牙本質細胞除了具有形成牙本質有機基質的能力外，還能釋放細胞因子、趨化因子和抗菌肽等，從而參與了牙髓牙本質復合體的天然及獲得性免疫防御反應，利于清除入侵病原體。然而，成牙本質細胞確切的防御機制、它們如何識別和捕獲外來抗原這些問題尚不清楚。Toll樣受體是新近發(fā)現的最重要的病原相關分子模

2、式識別受體，能識別包括細菌、支原體、病毒等各種外源性配體或壞死細胞、纖維連接素等內源性配體并迅速告知宿主發(fā)揮重要的頇警作用。TLRs在機體天然免疫和獲得性免疫之間架起一座橋梁，協調天然免疫和獲得性免疫以共同抵抗病原微生物或病變壞死組織等?，F今已發(fā)現10個人類Toll樣受體家族成員，它們分別對不同的病原體相關分子模式進行識別。TLR4是研究最早，功能最為明確的TLRs家族成員，它能夠與脂多糖(1ipopolysaccharide．LPS)和熱休克蛋白等內、外源性配體結合。牙髓、根尖周病是以(3-感染為主的混合感染，LPS是革蘭陰性菌最主要的毒力因子。那么成牙本質細胞和牙髓組

3、織是否通過表達TLR4等TLRs進行免疫防御的?TLR4信號通路是否影響牙髓損傷修復?我們用四個部分對此進行了研究。第一章Toll樣受體4在人正常牙髓組織和成牙本質細胞中的表達Toll樣受體4在牙髓組織和成牙本質細胞中的表達和意義中山大學博士學位論文目的：研究人正常牙髓組織和成牙本質細胞中TLR4表達與分布特點，探討TLR4在牙髓組織天然免疫防御中的可能作用。方法：從新鮮拔除的人健康第三磨牙獲取牙髓組織和成牙本質細胞，掃描電鏡觀察牙髓摘除后髓腔壁成牙本質細胞形態(tài)和附著情況；RT—PCR檢測人牙髓組織以及成牙本質細胞中TLR4mRNA的表達情況；采用免疫組織化學技術和免疫印

4、跡方法檢測TLR4蛋白的表達與定位。結果：掃描電鏡觀察牙髓摘除后成牙本質細胞大部存留在髓室壁上，細胞形態(tài)良好；RT．PCR結果發(fā)現正常牙髓組織、成牙本質細胞均可表達TLR4mRNA，產物大小為278bp；免疫印跡法檢測正常牙髓、成牙本質細胞在89kDa附近出現蛋白條帶；免疫組化顯示正常牙髓組織中的成牙本質細胞、血管內皮細胞TLR4免疫反應陽性。正常牙髓中牙髓成纖維細胞不表達TLR4。結論成牙本質細胞通過表達TLR4參與牙髓牙本質復合體的先天免疫反應，TLR4在牙髓抵御外來病原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。第二章Toll樣受體4在人炎癥牙髓組織和大鼠牙髓損傷修復模型

5、中的表達目的：研究TLR4在人炎癥牙髓組織以及大鼠牙髓損傷修復模型中的分布及表達情況，了解TLR4與牙髓炎癥發(fā)生以及炎癥損傷修復的關系。方法：收集人炎癥牙髓組織標本，采用免疫組織化學技術對TLR4的表達進行定位，同時利用免疫印跡雜交的方法對蛋白表達水平進行半定量分析。利用髓腔單純開放法建立大鼠牙髓損傷修復模型，通過組織病理學檢查觀察牙髓炎癥發(fā)生與轉歸的整個過程，利用免疫組化技術定位TLR4陽性細胞。結果：westernblotting結果顯示人炎癥牙髓組織TLR4的相對表達量是正常牙髓組織的兩倍左右，經studentt檢驗，兩者有顯著性差異(p

6、現正常情況下不表達TLR4的牙髓成纖維細胞也有TLR4的表達。利用髓腔單純開放法成功建立了大鼠牙髓損傷與修復模型，觀察到28d左右有修復性牙本質橋形成。免疫組化檢測觀察到TLR4陽性的成牙本質細胞樣細胞向成牙本質細胞受損處遷移并形成第三期牙本質。結論：炎癥牙髓TLR4表達上調，TLR4參與了牙髓組織炎癥發(fā)生以及損傷修復的過程。第三章Toll樣受體4在牙髓細胞向成牙本質細胞分化過程中的表達Toll樣受體4在牙髓組織和成牙本質細胞中的表達和意義中山大學博士學位論文目的：建立成牙本質細胞樣細胞體外培養(yǎng)體系，研究TLR4在體外培養(yǎng)的牙髓細胞向成牙本質細胞分化過程中的表達情況，對體

7、內研究結果進行驗證。方法：利用組織塊酶解法培養(yǎng)人牙髓細胞并進行鑒定，使用礦化誘導液誘導牙髓細胞向成牙本質細胞樣細胞分化。觀察細胞形態(tài)改變和堿性磷酸酶活性變化，用Vonkossa染色法觀察誘導后的細胞形成礦化結節(jié)的能力，對細胞增殖情況使用流式細胞儀進行細胞周期測定。以免疫熒光FITC法觀察TLR4在誘導分化后的細胞中的表達，采用RT-PCR檢測與成牙本質細胞分化相關基因以及TLR4基因在誘導分化過程中的表達情況，同時用westernblotting方法檢測誘導過程中TLR4蛋白表達情況。結果：獲得的牙髓細胞均為波形絲蛋白陽性，角