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1、·2011屆碩士研究生畢業(yè)論文Toll樣受體4在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義75%酒精495ml濃鹽酸5ml(3)10%碳酸鋰：飽和碳酸鋰40ml蒸餾水360ml(4)0.01mol/LPBS(Ph=7.4)(5)0.011mol/L檸檬酸緩沖液(pH=7.6)(6)DAB顯色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)(7)3%過氧化氫溶液(8)10%中性福爾馬林溶液：甲醛100mlNa2HPO44gNaH2PO46.5g蒸餾水~1000ml（9）0.01M/L的PBS(PH7.2)NaCl8gNa2HPO41.15gKH2PO
2、40.2g（NaH2PO4）加雙蒸水~1000ml（10）pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液0.1M枸櫞酸枸櫞酸21.01g雙蒸水~1000ml0.1M枸櫞酸鈉枸櫞酸鈉29.41g雙蒸水~1000ml取0.1M枸櫞酸9ml和0.1M枸櫞酸鈉41ml，再加入雙蒸水450ml，即配成0.1M的枸櫞酸緩沖液（pH6.0±0.1）。4.2.2免疫組化具體步驟如下（Envision兩步法）：取腎臟組織↓10%中性甲醛固定···6···2011屆碩士研究生畢業(yè)論文Toll樣受體4在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義↓脫水、透明和
3、石蠟包埋↓石蠟切片3um厚，72℃烘烤1h↓石蠟切片常規(guī)脫蠟、酒精梯度水化至水↓PBS洗3×5min↓3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下孵育15min↓PBS洗3×5min↓高壓鍋進(jìn)行高壓熱修復(fù)，煮沸噴氣后計(jì)時(shí)3min(0.01M檸檬酸鈉鹽pH6.0，2000ml，將切片浸入，自然冷卻)↓PBS洗3×5min↓滴加一抗抗體作用，4℃孵育過夜↓PBS洗3×5min↓滴加二抗免疫組化試劑，370C，20min↓PBS洗3×5min↓滴加DAB顯色(新鮮配制)，光鏡下控制顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)↓蘇木
4、素襯染5min，水洗↓鹽酸酒精分化3sec，水洗。碳酸鋰藍(lán)化↓酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)樹脂封片↓結(jié)果：陽性呈棕黃色或黃褐色每批染色均用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，對(duì)應(yīng)陽性切片作陽性對(duì)照0.1結(jié)果評(píng)價(jià)0.1腎小管間質(zhì)的病理改變切片經(jīng)HE染色后，在顯微鏡200倍下依序分別在左上、左下、右上、右下、中間各取2個(gè)視野，每張切片共10個(gè)視野，依據(jù)腎間質(zhì)纖維化、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞···7···2011屆碩士研究生畢業(yè)論文Toll樣受體4在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義浸潤(rùn)、腎間質(zhì)水腫、紅細(xì)胞管型、蛋白質(zhì)管型、腎小管擴(kuò)張
5、、腎小管萎縮、腎小管細(xì)胞空泡變性等8項(xiàng)指標(biāo)來觀察腎間質(zhì)病理改變，并作腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)（tubulointerstitialdamageindex，TDI）評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①腎間質(zhì)纖維化：無0分；輕度（累及范圍<25%）1分；多灶狀（累及范圍25%—50%）2分；彌漫性（累及范圍>50%）3分；②腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)：無0分；輕度（累及范圍<25%）1分；多灶狀（累及范圍25%—50%）2分；彌漫性（累及范圍>50%）3分；③腎間質(zhì)水腫：小管互相緊靠0分；小管間有輕度節(jié)段分離1分；小管間有彌漫輕度
6、或中度節(jié)段分離2分；小管上皮細(xì)胞變薄與小管基底膜彌漫性分離3分；④紅細(xì)胞管型：無0分；偶見1分；<10%2分；>10%3分；⑤蛋白管型：無0分；偶見1分；<10%2分；>10%3分；⑥腎小管擴(kuò)張：···8···2011屆碩士研究生畢業(yè)論文Toll樣受體4在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義無0分；輕度擴(kuò)張1分；伴隨有小管上皮扁平的中度擴(kuò)張2分；小管直徑超過小球直徑的中度擴(kuò)張3分；⑦腎小管萎縮：無0分；輕度（累及范圍<25%）1分；多灶狀（累及范圍25%—50%）2分；彌漫性（累及范圍>50%）3分；⑧上皮細(xì)
7、胞空泡變性：無0分；輕度或節(jié)段1分；彌漫輕度或節(jié)段中性2分；嚴(yán)重并彌漫3分；0.1免疫組化檢測(cè)檢測(cè)指標(biāo)為：TGF-β1、TLR4。組織染上棕黃色或黃褐色為陽性表達(dá)，主要累及腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)。采用Biomias2001圖象分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖象圖形研究所制)對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行免疫組化半定量分析。方法如下：1、在X400倍OLYMPUS(BX50)光學(xué)顯微鏡下，通過SONY攝像頭將腎組織免疫組化染色切片圖象采集并輸入本圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值測(cè)量。2、每例標(biāo)本分別隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野選取5個(gè)陽性區(qū)
8、域用目標(biāo)測(cè)量法測(cè)量透光度，計(jì)算其平均灰度值，表達(dá)信號(hào)越強(qiáng)，其灰度值越低。0.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差齊者，多組間采用單因素方差分析（OneWayANOVA），組間兩兩比較用LSD法；如方差不齊，采用Tamhane’sT2法；各項(xiàng)指標(biāo)之間做Pearson相關(guān)分析。以上均以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！ぁぁ?···2011屆碩士研究生畢業(yè)論文Toll樣受體4在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及意義結(jié)果0.1腎臟的
