資源描述：
《家蠶bm040825基因的表達(dá)與其功能初步的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文家蠶Bm040825基因的表達(dá)及其功能初步研究摘要我們從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中篩選得到一條新的cDNA，經(jīng)NCBI比對分析后初步確定其為一未知基因，命名為家蠶Bm040825(Bombyxmori040825)，GenBank登陸號為DN236938。家蠶Bm040825基因cDNA長為869bp，開放閱讀框大小為489bp，采用DNAStar軟件進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因編碼162個氨基酸殘基，預(yù)測分子量大小為19．4kD，等電點為9．58。從GenBank等數(shù)據(jù)庫中利用Blast檢索，發(fā)現(xiàn)
2、與Bombyxmori同源性較高的均為一些假設(shè)或預(yù)測蛋白，這些蛋白功能未知。將家蠶Bm040825的cDNA序列與家蠶基因組序列比對，結(jié)果表明該基因由一個外顯子組成。我們根據(jù)cDNA序列的ORF框設(shè)計上下游引物，PCR擴(kuò)增后經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，插入融合表達(dá)載體pET-28a(+)的相應(yīng)酶切位點，成功構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確。IPTG誘導(dǎo)后裂解菌作SDS-PAGE分析，在23kD處有一濃集特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符。重組蛋白以
3、可溶的形式表達(dá)，通過親和層析純化了重組蛋白，并使用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制各多克隆抗體，ELISA檢測效價大于1：6400。以家蠶Bin5細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實驗，結(jié)果顯示，在未分裂細(xì)胞中，Bm040825蛋白在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中均有分布，而對于處在分裂期的細(xì)胞，Bm040825蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核內(nèi)幾乎不存在。構(gòu)建綠色熒光重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-Bm040825轉(zhuǎn)染家蠶Bm5細(xì)胞做亞細(xì)胞定位，在轉(zhuǎn)染后36h，我們只在細(xì)胞核當(dāng)中檢測到綠色熒光信號，而轉(zhuǎn)染后48h，在細(xì)胞核和胞質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)融合綠色熒光的
4、分布。提取家蠶五齡幼蟲各組織的總蛋白，進(jìn)行免疫印跡實驗，結(jié)果顯示，Bm040825蛋白在家蠶的中腸組織中有表達(dá)，但在絲腺等其他組織中沒有檢測到該蛋白的存在，我們認(rèn)為該蛋白屬家蠶中腸特異性蛋白。這些結(jié)果為深入研究Bm040825蛋白奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞家蠶；Bm040825基因；亞細(xì)胞定位；免疫細(xì)胞化學(xué)；蛹Ⅱ浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文StudyontheexpressionandfunctionalanalysisofBm040825genefromsilkwormpupa(Bombyx肌D功AbstractAccording
5、tothelarge—scaleeDNAsequencingofsilkwormpupae，auniqueunknownBombyxmorieDNAwasidentifiedafterBlastbasedonNCBIdatabase．WepreliminarynominatethisnovelgeneasBm040825(BombyxmoriBm04082S)，andGenBankaccessionnumberisDN236935．Thelengthofthegeneis869bp．ItcontainsallORFof4
6、89bp，anditencodes162aminoacids、)l，itllthepredictedmolecularweightof19．4kDandisoelectriepointof9．58．AftertheBlastbasedonNCBIdatabase，wefoundthepredictedaminoacidsequencesofBm040825shareshighlyhomologoustothehypotheticalproteinandunknownprotein,andnleirfunctionsare
7、unknown．WealsotakegenomealignmentbetweenBm040825eDNAandsilkwormgenome，andtheresultsshowthatthisgeneincludesonlyoneexon．AccordingtotheORFofBm040825，twoprimersWeredesignedtoobtainthecodiIlgregionofBm040825genefromsilkwormpupaeESTdatabase．TheORFofthegeneWasclonedint
8、opET-28a(+)vector、jl，itllBamHIandXhoIdigest．TherecombinantplasmidWastransformedintoE．coliBL21(DE3)．PCRanddigestionwithBamHI／XhoIshowedthatthedesignedfragmentWa
