家蠶30k蛋白基因克隆表達(dá)及其抗凋亡功能的研究

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1、浙江理工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對(duì)所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：陸青玲≯斷如金日期：2012年3月12Et浙江理工大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)浙江理工大學(xué)可以將本學(xué)

2、位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于保密口，在不保密口√。學(xué)位論文作者簽名：陸青玲日期：2012年3月12日年解密后使用本版權(quán)書。指導(dǎo)教師簽名：于威葉、J日期：2012年3月12日本研究由浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y3090339)提供資助浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要家蠶30K載脂蛋白是家蠶幼蟲血淋巴中主要的一群低密度脂蛋白，除載脂功能，還具有較強(qiáng)的抑制昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的活性。體內(nèi)高血脂和自由基的堆積均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，從而引起其功能發(fā)生異常。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中具

3、有至關(guān)重要的作用。由于家蠶30K蛋白兼具載脂功能和抗細(xì)胞凋亡的活性，推測其可能具有抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能。因此，研究家蠶30K蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中的作用極可能具有重要意義，進(jìn)而可通過探索其藥用價(jià)值，為防治和治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供新途徑、新基礎(chǔ)。家蠶30K蛋白基因在進(jìn)化過程中產(chǎn)生很多種基因，編碼的蛋白均具有相似的結(jié)構(gòu)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)工具，根據(jù)已報(bào)道的具有抗細(xì)胞凋亡功能的家蠶30K蛋白基因BmLp．c6(GenBank登錄號(hào)：X54735)編碼的氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)分析，獲得兩個(gè)與BmLp．c6

4、同源性較高的家蠶30K蛋白其基因序列分別為BmLip．19G1(GenBank登錄號(hào)：AY568957)和BmLp．C12p(GenBank登錄號(hào)：NM001101728)。然后利用RT．PCR技術(shù)從家蠶蛹中克隆了上述三條家蠶30K蛋白基因，并在家蠶Bac-to．Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行大量融合表達(dá)、純化。表達(dá)產(chǎn)物純化后經(jīng)SDS．PAGE可檢測到純度較高的、分子量大小約為30kD的目的蛋白條帶。Westernblotting分析結(jié)果顯示3種目的蛋白與融合表達(dá)標(biāo)簽6×His．tag單克隆抗體具有良好的特異性反應(yīng)。利用自建的H202誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(叫vEC)的體外損傷及

5、凋亡模型，研究家蠶30K蛋白對(duì)H202誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的保護(hù)作用。MTT法檢測結(jié)果顯示：3種30K蛋白均可一定程度上增強(qiáng)HUVEC細(xì)胞的活力。對(duì)胞內(nèi)8．異前列腺素F2a(8-Isoprostane)(氧化應(yīng)激標(biāo)志物)濃度檢測結(jié)果顯示：利用H202處理HUVEC，可明顯增加胞內(nèi)8-isoprostane的濃度，而3種30K蛋白均可顯著降低胞內(nèi)8-isoprostane的濃度，表明3種30K蛋白均可通過降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激程度從而保護(hù)HUVEC。DNA片段化ELISA檢測結(jié)果顯示：3種30K蛋白均可降低HUVEC胞內(nèi)DNA片段化程度，表明3種30K蛋白對(duì)H202誘導(dǎo)的HUVE

6、C細(xì)胞的凋亡均具有一定的抑制作用。流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果也顯示：3種浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文30K蛋白均具有不同程度的降低HUVEC凋亡率的作用。綜上所述，3種家蠶30K蛋白均可通過抑制H202誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，本研究工作為今后進(jìn)一步探索家蠶30K蛋白的藥用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：家蠶30K蛋白；Bac．to．Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BEVS)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUvEC)；細(xì)胞凋亡Il浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文Cloning,ExpressionandAnti--apoptoticFunctionAnalysesof30KProteinsfromBom

7、byxmoriAbstract30Kapolipoproteinsareamajorgroupoflow-densitylipoproteininlarvaehemolymphofBombyxmori，besidesthebiologicalfunctionofearringlipoids，theyalsohaveproviouslyanti-apoptoticactivitiesininsectcellsandmammaliancells．Highbloodcholesterolandfleeradi