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《ing4基因重組表達(dá)及抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)的研究》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、m日基因重組表達(dá)及抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要NG4基因重組表達(dá)及抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要目的:先從小鼠肝組織中克隆ING4基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0一ING4,研究ING4對人肝癌SMMC7721細(xì)胞、人宮頸癌Hela紐亳、人胃癌SGC7901細(xì)胞的作用;再構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-21a(+).ING4并表達(dá)純化和制各多克隆抗體。方法:采用RT-PCR技術(shù)從小鼠肝組織中克隆ING4基因,將其構(gòu)建至pUCm—T載體上,經(jīng)測序鑒定正確后,再構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-21a(一)一ING4和p
2、cDNA3.0.ING4,采用PCR、雙酶切和基因測序鑒定。(1)利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine分別將pcDNA3.0一ING4轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)魚、人肝癌SMMC7721細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)毫。然后分別用RT-PCR、流式細(xì)胞儀、激光掃描關(guān)聚焦顯微鏡及Hoechst33258核染色等方法鑒定ING4基因的表達(dá)和研究其對幾種腫瘤細(xì)墮的抑制作用,同時(shí)還將ING4和n.24對SMMC7721細(xì)胞的作用進(jìn)行匕較。(2)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒pET-21a(+)一ING轉(zhuǎn)化
3、大腸桿菌BL21(DE3)并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),用SDS—PAGE凝膠電泳檢測ENG4蛋白表運(yùn)情況。ING4原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)初步純化后,免疫家兔制備多克隆抗體。結(jié)果:RT-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,可見750bp大小自jDNA片段,與理論預(yù)測結(jié)果相符,測序結(jié)果與GenBank報(bào)道的序列相比,除有一個(gè)堿基發(fā)生同義突變外其余均一致,原核和真核重組表達(dá)ING彳基因重組表達(dá)及抗胖蓿效旦拘實(shí)驗(yàn)研究中文摘要質(zhì)粒構(gòu)建正確。結(jié)果顯示ING4基因不僅可在COS.7和多種腫瘤細(xì)胞(人肝癌SMMC7721細(xì)胞
4、、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人胃癌SGC7901細(xì)胞)中表達(dá),而且具有誘導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)研究表明IL一24也具有促使腫瘤SMMC7721細(xì)胞凋亡的作用。原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS.PAGE凝膠電泳檢測出現(xiàn)30kD左右的條帶,與預(yù)測目的條帶大小接近,兔抗鼠多克隆抗體制各成功。結(jié)論:該基因系國內(nèi)首次獲得并經(jīng)序列測定證實(shí)的小鼠1NG4基因。為進(jìn)一步研究ING4基因抗腫瘤的分子機(jī)制及開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因治療載體奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:ING4;凋亡;真核表達(dá):原核表達(dá)II作者:王金志指導(dǎo)老師:楊吉成教
5、授Theexperimentalstudyonrecombinantexpressionandanti.tumoreffectofING4AbstractObjective:(1)ToconstructpeDNA3.0一ING4recombinanteukaryoticexpressionplasmidandexploretheeffectofING4onsomekindsoftumourcells;(2)ToconstructpET-21a(+)recombinantprokaryoticexpres
6、sionplasmidandpreparethepolyclonalantibodyMethods:UsingRT-PCRmethod,thecDNAencodingthemouseING4wasisolatedwithtotalRNAextractedfrommouselivertissue.(1)ThecDNAfragmentXVS5clonedintotheeukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.0.ING4,AnalysisofPCR、restrictionenzym
7、edigestionandDNAsequencingwerecarriedouttodemonstratethesequenceoftheplasmid,ThenWetransfecteditintosomekindsoftumurcellsbyLipofectaminetostudytheexpressionandthefunctionofING4;(2)ThecDNAfragmentwasclonedintotheprokaryoticexpressionplasmidpET-21a(+).Anal
8、ysisofPCR?restrictionenzymedigestionandDNAsequencingl{’erecarriedouttodemonstratethesequenceoftheplasmid,ThenthepET-21a(+)-ING4wastransformedintoE.eoliBL21(DE3),recombinantproteinwasexpressedinE.colihoststrainBL21(DE3)inth