法夫酵母搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化和高產(chǎn)蝦青素菌株誘變選育

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1、周元元：法夫酵母搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化和高產(chǎn)蝦青素菌株誘變選育!摘要蝦青素是一種具有極強(qiáng)的生物抗氧化性的酮式類胡蘿b素，在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面有著極廣闊的應(yīng)用前景。法夫酵母(Phaffiarhodozyma)是生物合成蝦青索的一個(gè)十分重要的生物來源。野生型法夫酵母菌株蝦青素產(chǎn)量很低，發(fā)酵溫度低，缺少實(shí)用價(jià)值。因此，本研究對法夫酵母的搖瓶發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)進(jìn)行了法夫酵母菌株傳統(tǒng)選育法夫酵母高產(chǎn)菌株誘變篩選的條件，利用紫外和氯化鋰復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)耐高溫的菌株UL-40。主要研究結(jié)果如下：1．觀察了法夫酵母搖瓶發(fā)酵144dx時(shí)內(nèi)的生長情況，測定法夫酵母的生物量、類胡蘿b素產(chǎn)

2、量和培養(yǎng)基中的殘?zhí)?，并且在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察了細(xì)胞類胡蘿b素的合成。結(jié)果表明，在發(fā)酵96d'時(shí)時(shí)類胡蘿b素產(chǎn)量達(dá)到了最高值。而生物量則是在48小時(shí)就達(dá)到了最高值，培養(yǎng)基中的殘?zhí)窃?8小時(shí)幾乎消耗殆盡。2．分別進(jìn)行了接種時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量對法夫酵母搖瓶發(fā)酵過程的影響的實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的搖瓶發(fā)酵條件為：種瓶至搖瓶的接種時(shí)間為48hr，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，接種量為10％，裝液量為50mL。比較]'DMSO法、酸熱法、堿法和自溶法等破壁方法和提取溶劑之間的差別，確定了酸熱法和丙酮分別為合適的破壁方法和提取溶劑。3．利用SAS軟件中的Plackett．Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)

3、面分析法對搖瓶發(fā)酵時(shí)的溫度、初始pH值以及發(fā)酵培養(yǎng)基的八種組分進(jìn)行優(yōu)化組合，從八個(gè)考察因素中選出發(fā)酵溫度、初始pH值和Comsteepliquor濃度為重要因素，通過響應(yīng)面分析法建立了模型：Y=3．6191-0．4633X1+0，1059X2—0．2454Xll一5．1102XIz_0．0630X2Z-0．2212Xll‘+O．0934XlX2．0．1286X1X11．0．2377XzXll，并從該模型中計(jì)算出在發(fā)酵溫度為16．78"C、初始pHYb4．73和csL濃度為7．06mg／L時(shí)預(yù)測的最大響應(yīng)值為3．9407mg／L，經(jīng)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)此點(diǎn)的實(shí)測值為3．9261mg／L，證明模型

4、是有效的，并且存在極大值點(diǎn)。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基，法夫酵母菌株蝦青素產(chǎn)量較原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了20．4％。4，通過實(shí)驗(yàn)確定了紫外線最適誘變劑量為30W、20cm下照射3min、亞硝基胍的最適誘變劑量15％g／mL以及篩選劑B．紫羅酮、硫酸銅、2一脫氧．D．葡萄糖、氯化鋰的篩選劑量分別為0．4～0．69／L、0．6～0．8ejL、lg／L和39／L，而二苯胺則由于抑制色素合成的能力太強(qiáng)烈而不適宜用作篩選劑。對原始菌株1．14—22進(jìn)行了紫外線一揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文氯化鋰復(fù)合誘變法夫酵母。經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，獲得了一株遺傳性狀穩(wěn)定、在25℃條件下蝦青素高產(chǎn)的菌株UL-40。其類胡蘿b素產(chǎn)量

5、為7．10mg／L。經(jīng)高效液相色譜測定，色素組成中，蝦青素為其主要成份。其蝦青素產(chǎn)量為643．97I_tg／g，比出發(fā)菌株提高了249．87％。關(guān)鍵詞：蝦青素，法夫酵母，復(fù)合誘變，優(yōu)化發(fā)酵條件，SAS軟件，篩選劑，NTG，UV周元元：法夫酵母搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化和高產(chǎn)蝦青素菌株誘變選育!ABSTRACTAstaxanthinisakindofketocarotenoidwhichhasapowerfulbiologicalantioxidantactivityandhasbeenappliedinseveralfields，suchasinmedicine，foodandcosmeticeta

6、1．Phaffiarhodozymaisanimportantbiologicalresourceforastaxanthin，butithasseveraldisadvantagesinthesynthesisofastaxanthin，suchaslowproductionofastaxanthin，lowfermentationtemperatureandlesspracticalvalue．SoscreeningfurhighyieldstrainsofPhaffiarhodozymawi也normalfermentationcondtionsisveryimportantboth

7、fortheoreticalandpracticalapplicationInpresentstudy,thefermentationconditionsofPrhodozymahadbeenoptimizedinrockingflasksbyusingPlackeR-BurmandesignandResponseSurfaceAnalysisprovidedbySASsoftware，andtheadaptivedos