流行性乙型腦炎病毒sa14142株全基因組序列分析與e蛋白抗原表位鑒定

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1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博十學(xué)位論文摘耍摘要流行性乙型腦炎(Jap揪encephalitis，JE)是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一種以蚊蟲為媒介傳播的人和動(dòng)物共患的病毒性疾病，對(duì)人類危害巨大，是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的蟲媒病之一，對(duì)豬可引起繁殖障礙，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失．豬是JEV的中間宿主，帶毒豬是本病的主要傳染源。因此，控制豬的JE不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)而且對(duì)人類健康都具有十分重要的意義。本研究首先根據(jù)已發(fā)表的JEVSAl4-14-2株基因序列設(shè)計(jì)合成了4對(duì)引物，通過(guò)RT-PCR從乙腦病毒SAl4-14-2株

2、經(jīng)BHK21細(xì)胞傳至第20代的毒株SAl4．14-2一B20中擴(kuò)增得到了覆蓋乙腦病毒基因組全長(zhǎng)的4個(gè)cDNA片段，將所得片段克隆至pMDl8．T載體上，經(jīng)測(cè)序和拼接后，獲得了JEV基因組全序列(sAl4-14．2-B20)。序列分析表明，該JEv基因組全長(zhǎng)10977bp，含有1個(gè)大的開放閱讀框架，編碼1個(gè)由3432個(gè)氨基酸殘基組成的聚合蛋白，其5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)分別由95和583個(gè)堿基組成。將此全序列與SAl4源病毒株核苷酸、氨基酸進(jìn)行比較，同源性均在990．6以上，突變位點(diǎn)分教于各個(gè)區(qū)域，而且發(fā)現(xiàn)SAl4．14．2．B20一些位點(diǎn)和SA(A)及野毒株SAl4核苷

3、酸、氨基酸序列相同而與疫苗株SAl4-l鉈不同。推測(cè)這些區(qū)域可能與減毒沒有關(guān)系。發(fā)現(xiàn)SAl4．14-2．B20在3’非編碼區(qū)第10701位插入一個(gè)堿基G。比較了31株JEV全序列的3’非編碼區(qū)，結(jié)果提示10701位堿基G插入?yún)^(qū)域可能是JEV易變位點(diǎn)．將SAl4．14-2．B20序列與GenBank發(fā)表的31株JEV全序列進(jìn)行同源性分析，以進(jìn)一步了解JEV之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。本研究所獲得的SAl4-14-2-B20株全序列測(cè)定，一方面有助于揭示病毒的致病和減毒機(jī)理，另一方面也為減毒活疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量控制，主要為監(jiān)控可能發(fā)生的回復(fù)突變提供分子基礎(chǔ)。此外，病毒基因組全序列cDNA

4、克隆的建立為進(jìn)一步進(jìn)行感染性克隆的研究莫定了基礎(chǔ)．E蛋白是JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、細(xì)胞趨向性、病毒毒力和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)中起重要作用。本試驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增EFI(1-291aa)、EF2(292-402aa)和EF3(403~5∞aa)3個(gè)片段，PCR產(chǎn)物分別定向克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-!中，經(jīng)誘導(dǎo)各融合蛋白均以包涵體的形式表達(dá)．兔抗SAl4—14-2病毒血清的ELISA和Westernblot結(jié)果均表明EFI和EF2片段1-402aa是E蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)決定區(qū)．為對(duì)這一免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)域進(jìn)行抗原表位鑒定，設(shè)計(jì)一套52個(gè)部分重疊的短肽，這些短肽覆蓋

5、全部l--402aa片段。將每一個(gè)短肽基因序列分別合成一對(duì)寡核苷酸鏈，退火后插入表達(dá)載體pGEX-6p-!，與GST進(jìn)行融合表達(dá)，多數(shù)表達(dá)的融合蛋白以可溶解的形式存在。用JEV陽(yáng)性血清進(jìn)行Westernblot和ELISA掃描，鑒定出11個(gè)抗原表位，分別為E1(1～16aa)．E10(73--88aa)，Ell(81--96aa)、E19(145-160aa)、E33(257～272aa)、E39(305—320aa)、E45(353～368aa)、E47(369-384aa)、E48(377-392aa)、E49(385—100aa)和E63(373-388aa)。通過(guò)

6、Westemblot蛋白免疫印記對(duì)鑒定的抗原表位進(jìn)行精細(xì)分析，最終確定為9個(gè)抗原表位：E1(!-16aa)、EIO-4(77—84aa)、ElI-2(83--94aa)、E19(145～160aa)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博I。擘tj=論文摘瓔E33(257—272aa)、E39-2(309～316鋤)、E45—3(359～362aa)、E48一l(377—384aa)、E49(385---400aa)．應(yīng)J}j此9個(gè)融合蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，結(jié)果表明9個(gè)融合蛋白均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)短肽的特異性抗體。且通過(guò)中和試驗(yàn)鑒定出E10(73,--88aa)、E39(305-320aa)為線

7、性中和表位．其中表位E10與現(xiàn)有的報(bào)道區(qū)域重疊，另一個(gè)中和表位E39為新確定的。將鑒定的表位合成多肽，混合包被ELISA扳，證實(shí)可以用丁檢測(cè)豬血清。本研究對(duì)JEVSAl4．14-2株E蛋白進(jìn)行抗原表位的鑒定，將有助于進(jìn)一步闡明E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，將為建立以表位為基礎(chǔ)的抗原抗體診斷方法和基于表位疫苗的設(shè)計(jì)研究提供重要的研究工作基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：乙型腦炎；序列測(cè)定；E蛋白；抗原表位n中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博I。學(xué)位論文AbstractJapanese∞cephalitisvirus(JEV)，beingamemberofthefamilyFl