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《人胰島素樣生長因子-ⅰ基因在巴斯德畢赤酵母中分泌表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、中文摘要人的胰島素樣生&因子一I是存在于人體多種組織中的具有多種重要生理功能的細胞網子。它的缺乏會導致多種嚴重的疾病。因而它也成為具有多種治療川途的藥物。本研究目的是利州畢赤酵母表j厶系統(tǒng)高教地表達這種蛋白。本研究利_}}JPCR引入突變的方法成功地改造胰島素樣生長困子一l的基因序列以滿足畢赤酵母對密碼子的偏好性，以期提高其在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達水平。成功地將改造過的人胰島素樣生妖網子基嘣定向克隆劍畢赤酵母襲達載體上。把構建好的表達載體轉入巴斯德畢赤酵母中，經歷組氨酸缺陷培養(yǎng)基的篩選和禽有不同濃度G418的培養(yǎng)基的多次篩選，獲得9個能在含5．Omg／mlG418YP
2、D培養(yǎng)基上生K克隆。PCR鑒定表明：胰島素樣生長因子I基因已經成功地整合進入畢赤酵母GSll5的基岡組中。挑選其中的1個克隆在恒溫振蕩器實行誘導表達。分別在第48、72、96、120小時取上清，川硫酸銨沉淀蛋白。經過SDS—PAGE電泳顯示：表達的外源蚩白與目標蛋白人小一致。Westernbloting表明它就是我們所要表達的目標蛋白。經測定，96小時的培養(yǎng)I二清中目標蛋白的表達量約為400mg／L，約11i培養(yǎng)上清總蛋白的50％。我什J的r[作為進一步篩選更高表達菌株，活性的測試，以及臨床應用打。卜_一定的基礎。關鍵詞：人胰島素樣生氏網子一I，畢赤酵母，分泌表達，pP
3、IC9K，6S115AbstractHumaninsulin—likegrowthfactor-1whichliesinmanyhumantissuesisanimportantcellfactorwithmanyimportantphysiologicalfunctions．Theabsenceofthefactorwillcausemanyseriousdeseases．Thusitmaybepharmaconwithmulti-function．ThisreserchaimstoexpresstheproteininhighlevelwitllPichiapast
4、orisexpresssystem．Inthisresearchwesuccesfullychangedthesequenceofinsulin—likegrowthfactor．1genewithPCRtomeetthepastorispichia’sfavoritesoasforachievinghi曲expressinglevelinpichiapastorisexpresssystem．ThechangedgenewasclonedinorientationintopPIC9Kvector．Theconstructedvectorwastransformedin
5、topichiapastoris．AftersecreeninginMDmediumandinYPDmediumwithdifferentconcentrationsG418，nineclonesremaininYPDmediumwith5．0mg／mlG418PCRanalysisoftherecombinantsshowedthatthehumaninsulin·likegrowthfactor．1genehadsuccessfullyintegratedintothepichiapastorisGSI15genome．Oneclonewaspickedtocult
6、uremediumandindueedtoexpresstherecobinantfactor．After48hours、72hours、96hoursand120hourstheculturesupernatantwascollectedandtheammoniumsulfatewasusedtoprecipitatetheproteinintheculturesupematant。SDS—PAGEshowsthatthecuturesupematantcontaintheproteinthatisfamiliarwithouraimedproteininsize．W
7、esternBlottingshowstheproteiniswhatwegofor．Thetargetproteininthe96hours‘culturesupematantisattheconcentrationofabout400mg／Landabout50％oftotalproteinintheculturesupernatant．Ourworkmakesgoodfoundationfurfurtherreserchsuchasproteinactivitytest，screeningrecombinantstrainswith
