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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文人肥胖基因在畢赤酵母中的表達姓名：聶芬申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：水生生物學(xué)指導(dǎo)教師：龍良啟20060601人肥胖基岡在畢赤酵母中的表達摘要肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)(1eptin)是反映體內(nèi)脂肪含量和調(diào)節(jié)體重的重要信號因子，leptin能顯著降低脂肪組織數(shù)量、促進青春期發(fā)育，對機體的免疫應(yīng)答、繁殖功能、神經(jīng)內(nèi)分泌等功能具有重要的作用。本文根據(jù)己報道的人肥胖基因cDNA序列設(shè)計引物，PCR擴增出人肥胖基因的cDNA編碼序列，然后將此定向克隆至畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K的a因子信號肽編碼序列37端，構(gòu)建成重組酵母表達載體，測序分
2、析表明該cDNA序列由438個核苷酸組成，編碼146個氨基酸組成的多肽。用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，經(jīng)PCR鑒定證實，目的基因整合到重組酵母菌染色體中，對重組酵母進行G418篩選和4天的誘導(dǎo)表達，然后對陽性克隆進行了為期4天的誘導(dǎo)表達，SDS．PAGE未檢測到目的產(chǎn)物的表達。根據(jù)巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的密碼子偏愛性，對肥胖基因進行了簡并改造和人工合成，然后將改造過的人肥胖基因以正確的讀碼框架插入到酵母分泌型表達載體pPIC9K的a因子信號肽編碼序列37端，構(gòu)建成重組酵母表達載體，測序結(jié)果與預(yù)期一致。重組酵母用同樣方法進行了為期4天的誘導(dǎo)表達，
3、并通過SDS—PAGE和放免檢測，得到一株表達目的蛋白量最高的重組酵母菌，該重組蛋白表達水平可達7．71mg／L，不同濃度G418篩選表明該酵母菌是高拷貝的。SDS．PAGE檢測表明分泌蛋白分子量約為16kD。關(guān)鍵詞：肥胖基因；瘦素；畢赤酵母；克??；表達華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2006屆碩上學(xué)位論義AbstractTheexpressionproductofobgene—leptinisanimportantsignalreflectingbodyfatmassandcontrollingweight，itCanremarkablycutdowntheamou
4、ntsoffatmass、stimulatethedevelopmentoftheadolescenceandalsoplaysanimportantroleintheimmunefunction，reproduction，neuroendocrinesecretion．SpecificprimersweredesignedtoamplifythecDNAfragmentencodinghumanleptin，then，thecDNAfragmentWasinsertedintothe3-endofCt—factorofyeastexpressio
5、nvectorpPIC9K．DNASequenceanalysisrevealedthatitconsistedof438nucleotidesthatencodeda146-aminopeptide．TherecombinantplasmidpPIC9K-obwastransformedintothegenomeofGS15bychemicalmethod．Thepositivetransformantswereinducedbymethan01．TheresultofSDS-PAGEdemonstratedthatthegenenearlyco
6、uldn’tbeexpressed．Togetahigherexpressionofhumanleptin，thehumanobgeneWasmodifiedandsynthesizedbymanualinthebasisofcodonbias，therecombinantplasmidwasconstructedandtransformedintothegenomeofGS15．ThemutipleinserttransformantswerescreenedbyG418andinducedbymethan01．After4daysofmetha
7、nolinduction，humanleptinwassecretedintothemedium．TheconcentrationofleptinexpressionsupematantWasabout7．71mg／LbyIRA．TheresultofSDS—PAGEdemonstratedthattheweightofthesecretedproteinWasapproximately16kD．Keywords：Obesegene；Leptin；Ppastoris；Cloning；ExpressionU人肥胖基因在畢赤酵母中的表達縮寫AmpBMM
8、YBMGYbp(s)BisddH20dNTPDTrEBEDTAghkbkDaLBmgmlnmLMMMDoboD0nPAGE
