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1、上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：)虱霉徊、J日期：∥8年F月yEl黝{寶嘲氣一上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電
2、子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)上海交通大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密囪，在上年解密后適用本授權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密口。(請?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“4”)學(xué)位論文儲簽名：僻緗指導(dǎo)教師簽名：日期：妒譬年與月FE1日期：圳年擴(kuò)月6日上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文小鼠和人胚胎千細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化摘要隨著老齡化時(shí)代的來臨，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病越來越引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。研究胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ES細(xì)胞)的體外神經(jīng)分化，得到大量的
3、神經(jīng)前體細(xì)胞和特定類型的神經(jīng)元，有望為早期神經(jīng)發(fā)育的研究、神經(jīng)藥理和毒理研究以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的細(xì)胞替代治療提供研究模型和細(xì)胞來源。本研究針對小鼠和人ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化進(jìn)行了研究，主要包括了以下兩方面的工作：(一)小鼠ES細(xì)胞的神經(jīng)分化：我們研究的重點(diǎn)和創(chuàng)新體現(xiàn)在密度對小鼠ES細(xì)胞神經(jīng)分化的效率和細(xì)胞類型的研究上。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠ES細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)環(huán)境里，ES細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)的接種密度對類胚體(embryonicbody，EB)質(zhì)量有很大的影響并影響隨后的神經(jīng)分化效率：當(dāng)小鼠ES細(xì)胞以較低密度(1×i05EScells／
4、m1)懸浮培養(yǎng)時(shí)，得到的EB形態(tài)較為均一，呈規(guī)則的圓形，耶的形態(tài)較緊密，邊界亮而光滑，這樣的EB貼壁培養(yǎng)后，神經(jīng)分化的效率較高，Nestin陽性細(xì)胞約占92％；小鼠ES細(xì)胞以較高密度(1×106EScells／m1)懸浮培養(yǎng)時(shí)，EB的大小不均一，形態(tài)不規(guī)則，邊界不光滑，這樣的EB貼壁培養(yǎng)后，神經(jīng)分化的效率較低，Nestin陽性細(xì)胞約占50％。本研究還發(fā)現(xiàn)，EB貼壁培養(yǎng)時(shí)的上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文接種密度也影響分化得到的神經(jīng)細(xì)胞類型：EB低密度貼壁培養(yǎng)后長出的細(xì)胞更傾向于表達(dá)后腦和脊髓特異性的定位基因Hoxb4、Hoxb9。(二)人E
5、S細(xì)胞的神經(jīng)分化：首先我們采用EB法進(jìn)行了人ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)分化，并且我們對該EB進(jìn)行了改進(jìn)，從而提高了誘導(dǎo)效率。我們的誘導(dǎo)方案的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是在EB形成階段，用化學(xué)成分明確的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基替代了以往報(bào)道中選用的含血清的培養(yǎng)基從而提高了誘導(dǎo)效率；二是在髓貼壁后長出的玫瑰花結(jié)樣結(jié)構(gòu)，我們用機(jī)械法挑取代替了以往報(bào)道中所采用的差別酶消化法從而提高了目的細(xì)胞的純度。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這些改進(jìn)可以明顯提高人ES細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)效率。盡管通過以上實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，我們用EB法誘導(dǎo)人ES細(xì)胞的神經(jīng)分化得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6、，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)類胚體法有很多不足之處。單層貼壁誘導(dǎo)法是一種新的神經(jīng)誘導(dǎo)方法，細(xì)胞的分化較同步；而且細(xì)胞的形態(tài)改變易于觀察，細(xì)胞的分化進(jìn)展易于通過免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)手段實(shí)時(shí)監(jiān)測。本研究在BMP4的抑制劑Noggin的作用下，應(yīng)有單層貼壁誘導(dǎo)法高效地把人ES細(xì)胞誘導(dǎo)成了神經(jīng)細(xì)胞，且神經(jīng)發(fā)生的時(shí)間早于EB法。我們的研究還初步證實(shí)，單層貼壁誘導(dǎo)法的早期即添加FGF8和SHH可以大大促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的分化，為我們下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：小鼠胚胎干細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)，神經(jīng)分化上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文NEURA
7、LDIFFERENTIATIoNOFMoUSEANDHUMANEMBRYoNICSTEMCELLSABSTRACTTheprevalenceofneurodegeneratiVedisordershasbeenincreasingeachyear．Embryonicstem(ES)cellsareexpectedtoprovideanewcellsourceforcellreplacementtherapiesforthesediseases．Neuralprecursorcellsandspecificsubtypeofneuro
8、nsderivedfrominvitroneuraldifferentiationofEScellsareusefulcellsourcesnotonlyintreatingneurodegeneratiVedisorders，but
