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《小鼠胚胎干細胞建系和定向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要小鼠胚胎干細胞建系與定向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的研究專業(yè)：干細胞與組織工程導(dǎo)師：余新炳教授；BruceT．Lahn博士研究生：張嘉晴中文摘要胚胎干細胞(embryoniCstem，ES)是指由早期胚胎內(nèi)細胞團(innercellmass，ICM)分離出來并建系成功的多潛能干細胞。具有自我更新能力和多向分化潛能，能在體外無限分裂增殖，并長期保持未分化狀態(tài)?？煞只癁槿砀鞣N類型的細胞，因具有比成體干細胞更高的增殖活性和更廣泛的分化能力，在細胞治療和組織更新領(lǐng)域具有巨大的潛力。目前，人們可以利用不同的培養(yǎng)條件將ES細胞定向誘導(dǎo)分化成不同類
2、型的細胞以作為細胞移植、組織替代，甚至器官克隆的細胞供體，為將來治療人類諸多難治性疾病提供細胞來源。此外，ES細胞還是胚胎發(fā)育機制、轉(zhuǎn)基因動物生成、組織更新等科研領(lǐng)域重要的工具細胞，但目前能夠得到的小鼠ES細胞系多來自于129小鼠。而科研應(yīng)用最廣泛的是近交系C57BL／6J小鼠的ES細胞系很少見。神經(jīng)退行性疾病(如，帕金森，老年性癡呆，癲癇等)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如中風(fēng)，腦缺血，脊髓損傷等)是多發(fā)性疾病，傳統(tǒng)的治療方法不能阻止病情的發(fā)展，二十世紀(jì)九十年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要移植可以
3、替代死亡或退變的神經(jīng)元，移植后可明顯改善上述疾病的臨床癥狀。這一成果對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性疾病的治療具有劃時代的意義。一系列的動物和臨床實驗表明，細胞替代治療是治療以功能神經(jīng)元減少或損傷為特點的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種理想的手段。但目前這種方法要應(yīng)用到臨床還受到多方面的限制，其中最主要的是細胞來源嚴重不足。人們曾把神經(jīng)干細胞視為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植和替代治療的理想材料，但是目前已有的研究顯示，NSCs在體外擴增的能力有限，而且隨著傳代次數(shù)的增加，分化能力和增殖能力下降。且無論胎兒還是成體的神經(jīng)干細胞均來源稀少。而ES細胞可在體外無限增殖且能分化為任何成體細
4、胞，包括神經(jīng)細胞。因此，ES細胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化成為目前科學(xué)研究的熱點課題。目前，對ES細胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干／祖細胞的研究很多，但多數(shù)誘導(dǎo)方法不成熟，ES細胞生成NSCs產(chǎn)率和純度不高，ES細胞分化產(chǎn)物還是由多種細胞成分組成。而細胞移植要求大量高純度的神經(jīng)細胞。為此，本課題首先建立C57BL／6J小鼠ES細胞系，并利用胎鼠來源的神經(jīng)干細胞的條件培養(yǎng)液作為主要誘導(dǎo)劑，探討一種新的、簡單高效的誘導(dǎo)方法，為臨床細胞替代治療提供大量的高純度的神經(jīng)細胞。全文包括三個部分：第1部分小鼠胚胎干細胞系的建立和鑒定1．目的建立C57BL／6J近交系和C57BL／
5、6J／129雜交小鼠ES系，摸索穩(wěn)定可靠的ES細胞建系技術(shù)，并對獲得的ES細胞系進行鑒定，為下一步誘導(dǎo)分化的研究提供可靠的工具細胞。中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要2．方法制備胎鼠成纖維母細胞(mouseembryonicfibroblast，MEF)作為飼養(yǎng)層細胞備用。促排卵3．5周齡雌性C57BL／6J小鼠，并與成年C57BL／6J或129雄鼠交配。在交配后3．5天，處死后打開腹腔，分離子宮，從兩側(cè)子宮角沖出囊胚，收集并放入有ES培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。3．5天后，從貼壁生長的囊胚中挑出內(nèi)細胞團(innercellmass，ICM)消化后，種入新鮮
6、的ES培養(yǎng)液。隨后鏡下觀察待飼養(yǎng)層細胞上出樣克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起的圓形或橢圓形細胞團，即為ES細胞，常規(guī)傳代培養(yǎng)即獲得ES細胞株。對所得ES細胞株進行堿性磷酸酶染色、SSEA．1和Oct．4表達檢測以及體內(nèi)分化能力和核形分析。用攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)基因的lentviral病毒，轉(zhuǎn)染包裝細胞293，獲取病毒上清，用病毒上清感染SCl002ES細胞．進行GFP基因標(biāo)記。3．結(jié)果所得4株ES細胞分別來自C57BL／6J和C57BL／6J×129雜交小鼠囊胚，各2株，命名為SCl001，SC
7、l002，SCl003，SCl004．4株ES細胞堿性磷酸酶染色均呈陽性，免疫組化和RT-PCR檢測Oct一4均顯著表達。SSEA．1染色陽性。體內(nèi)分化能力檢測表明，四株ES細胞均具有形成畸胎瘤的能力，鏡下觀察由三胚層細胞組成。核型分析均為二倍體：40，XY。攜帶GFP基因的lentivirus轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞成功，獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的ES細胞。4．結(jié)論獲得四株ES細胞分別來自C57BL／6J和C57BL／6J×129雜交小鼠囊胚，各中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要2株，命名為SCl001，SCl002，SCl003，SCl004。該細胞株均符合所
8、有胚胎干細胞的生物學(xué)特性。第2部分小鼠神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)及長期擴增體系的建立1．目的改進目前常用的分離培養(yǎng)
