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1、MDA和SOD的測定SOD活性測定(避光！)【實驗用品和儀器】手套、稱量紙、電子天平、250ml燒杯*1、500ml燒杯*1、100ml燒杯*2、50ml燒杯*6、玻棒*10、膠頭滴管*4、200ml量筒*1、100ml量筒*1、1000ml容量瓶*3、100ml容量瓶*3，200ml棕色容量瓶*1、150ml容量瓶*1、恒溫水浴鍋、研缽*n、離心管*3n、10ml帶塞試管*（n+1）、瓷盤、黑色塑料袋、黑色硬紙?zhí)?、離心機、人工氣候箱、分光光度計、比色杯*4、5ml移液槍、1ml移液槍、槍頭、鑷子、廢液缸
2、、和10ml小燒杯*（n+7）（n表示要做的樣品數(shù)，x表示分X組比色）【實驗藥品】液氮、冰、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、EDTA-Na2、核黃素、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）和去離子水【配制試劑】①50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖溶液（PBS）（含0.1mmol/LEDTA）。（1）磷酸緩沖液（母液）配制：磷酸A：0.2MNa2HPO4·12H2O：71.64g加水1000ml；磷酸B：0.2MNaH2PO4·2H2O：31
3、.21g加水1000ml。（2）磷酸A228.75ml+磷酸B21.25ml，加入EDTA-Na20.0372g；加水定容至1000ml。②220mmol/L甲硫氨酸：稱甲硫氨酸3.2824g，用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml（現(xiàn)用現(xiàn)配）。③1.25mmol/L氯化硝基四氮唑藍（NBT）：稱NBT0.1022g，用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml避光保存。（現(xiàn)配現(xiàn)用）（稱取時NBT的重量在0.102g-0.1025g之間均可，最好0.1022g）⑤0.033mmo
4、l/L核黃素：稱0.00252g用PBS溶解定容至200ml。（稱取時核黃素的重量在0.0025g-0.0026g之間均可，最好0.0025g）低溫避光保存，即用黑紙將裝有該溶液的棕色瓶包好，三天內有效。（現(xiàn)配現(xiàn)用）【SOD提取】（1）將鮮葉剪碎混勻，稱取0.5g（3份），放在研缽中，先用液氮研磨葉片，磨碎后加2mlPH7.8的PBS，研磨后轉移進離心管，加2+1ml清洗研缽。（2）4℃下10000r/min離心15min，上清液為樣品提取液。放在冰上避光保存?！維OD活性測定】①取5ml或10ml小燒杯
5、N+6只，N表示測定樣品數(shù)，另外6只為對照，其中CK（小燒杯放在大托盤中，盤里放冰）：一個黑暗（空白對照）；一個照光；（為保證測定，黑暗和照光都3個重復比較好）（不加酶液，以緩沖液代替）②按照下表加入各溶液（加試劑前確認關燈，過程必須避光，在使用核黃素前必須避光）試劑管號最終濃度0-暗（暗對照管）0-光（光對照管）1（樣品，3重復）磷酸緩沖溶液/ml4.14.14.05甲硫氨酸/ml0.30.30.313mmol/L氯化硝基四唑藍/ml0.30.30.375μmol/L核黃素/ml0.30.30.32.0
6、μmol/L酶液/ml000.05CK用PBS液代替總體積5.05.05.0①將上述試劑混勻后，0-暗對照燒杯置于暗處（加入核黃素立刻用雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓日{好人工氣候箱的溫度和光照再把0-光對照燒杯和樣品一起置于4000xl日光燈下反應20min（要求各管受光一致，反應溫度控制在25-35℃之間，溫度高時時間縮短，溫度低時可適當延長，視光下對照管的反應顏色和酶活性的高低適當調整反應時間）。②反應結束后，用黑布罩遮蓋小燒杯終止反應，以0-暗對照管做空白，在560nm處測定吸光度值?！居嬎恪縎OD活性=
7、〔（ACK-AE）*V/ACK〕*0.5*W*VtACK：照光CK吸收值AE：樣品管吸收值V：樣液總體積W：樣品鮮重Vt:測定時樣品用量SOD比活力=SOD總活力/蛋白質含量蛋白質含量單位為mg/gMDA含量測定(避光！)【配制試劑】①50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖溶液（PBS）②20%三氯乙酸（TCA）：稱20g三氯乙酸，用蒸餾水溶解并定容至100ml。可稱30g三氯乙酸，用蒸餾水溶解并定容至150ml。③0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：稱0.5g硫代巴比妥酸，用20%TCA溶解并定容至100ml
8、?！綧DA的提取】同SOD【MDA含量的測定】取上清液1.5ml于10ml帶塞試管中（對照管以1.5ml蒸餾水代替提取液還是PH7.8PBS），加入0.5%TBA2.5ml，混合后于沸水浴上反應20min，迅速冷卻后在3000r/min下離心15min，上清液分別于450nm、532nm和600nm波長處測定吸光度值。【計算】MDA濃度C（μmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450
