sod、pod、cat、mda和可溶性蛋白的測定

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1、SOD、POD、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸、電導(dǎo)率、可溶性糖的測定一、磷酸緩沖液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液稱取分析純KH2PO427.216克，用蒸餾水定容至1000毫升。B液：0.2M的K2HPO4溶液稱取分析純K2HPO4?3H2O45.644克，用蒸餾水定容至1000毫升?；颍ˋ液：0.2M的NaH2PO4溶液稱取分析純NaH2PO4?2H2O31.21克，用蒸餾水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液稱取分析純Na2HPO4?12H2O71.64克，用蒸餾水定容至1000毫升。）二、酶液的制備：稱取0.5g樣品放入研缽中，加2毫升0.05MPH

2、=7.8的磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨，勻漿倒入10毫升離心管中，再加3毫升磷酸緩沖液沖洗研缽，4℃冷凍離心20分鐘（若做可溶性蛋白，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，若不做，則10000轉(zhuǎn)/分鐘），上清液（酶液）倒入試管中，置于0~40C下保存待用。三、SOD的測定：1.SOD反應(yīng)液的配制：母液的配制：（1）0.05M磷酸緩沖液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2)130mMMet(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸緩沖液定容至100ml；棕色瓶避光4℃保存。（3）750μM四氮唑藍(lán)（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容

3、至100ml；棕色瓶避光4℃保存。(4)100μMEDTA-Na2:取0.0372gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml，棕色瓶避光保存；(5)20μMFD(核黃素):0.00753gFD用蒸餾水定容至1000ml。隨用隨配。棕色瓶避光保存；SOD反應(yīng)混液：磷酸緩沖液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例為15：3：3：3：2.5，按母液順序配制，然后依次加入核黃素和酶液。2.SOD的測定：取型號(hào)相同的試管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30分鐘，同時(shí)取兩支試管，一支做對(duì)照，一支做空白（對(duì)照、空白不加酶液，以緩沖液代替）；空白置暗處，對(duì)照（C

4、K）與酶液同置于4000Lux條件下照光30分鐘，反應(yīng)后遮光保存，以空白調(diào)零，560nm比色。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次（3試驗(yàn)+3空白+3對(duì)照）3.結(jié)果計(jì)算SOD總活性（吸光度/g·FW）=（ACK—AE）×V／（W×0.5×Vt×ACK）單位：NBT光還原50%為單位SOD比活性（酶單位/mg蛋白）=SOD總活性/蛋白質(zhì)濃度SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/gFW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；Vt為測定時(shí)的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。注意：1.要10ml離心管，不

5、要大試管，否則槍頭夠不著，不好吸；2．提取液預(yù)冷；3.測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量4.照光時(shí)間和強(qiáng)度嚴(yán)格控制，試管要透明，質(zhì)地均一。-3-四、POD的測定：1.0.1MPH6.0磷酸緩沖液的配制：A液219.25+B液30.75，定容至1000毫升；2.POD反應(yīng)液的配制：0.1MPH6.0的磷酸緩沖液50毫升于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28微升，磁力攪拌器加熱攪拌使之完全溶解，冷卻后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。3.POD的測定：20微升酶液+3毫升反應(yīng)液于比色皿中，以PBS為對(duì)照調(diào)零，在470nm下每隔1分鐘讀數(shù)一次，共讀三次，以每分鐘吸光度變

6、化值（ΔA470/min·mgpr或ΔA470/mgFW）表示酶活力的大小。結(jié)果計(jì)算：POD活性POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml）；Vs為測定時(shí)取用酶液體積（ml）五、MDA的測定：1.MDA反應(yīng)液的配置：0.6克TBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100毫升。1.MDA的測定：1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分鐘，迅速冷卻后1500轉(zhuǎn)10min離心，取上清液，在600、5

7、32、450nm三個(gè)波長下比色。2.結(jié)果計(jì)算：MDA濃度C(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/gFW)=C×V/WV為提取液體積(ml)，W為樣品鮮重(g)六、可溶性蛋白的測定反應(yīng)液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個(gè)月。100μg/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液:10mgBSA,0.9％氯化鈉溶解，