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《9甲氧基喜樹堿mcpt抗腫瘤作用及其機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofEngineeringStudyontheAnticancerActivityof9-Methoxycamptothecin（MCPT）anditsMechanismsPh.D.Candidate:HaiyanWangMajor:BiopharmaceuticalEngineeringSupervisor:Prof.LongjiangYuAssociateProf.MingzhangAoHuazhongUniversityofSc
2、ienceandTechnologyWuhan,Hubei430074,P.R.ChinaMay,2013華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文摘要喜樹堿（Camptothecin,CPT）由于高效、廣譜的抗腫瘤活性而位居癌癥治療前列，但明顯的毒副作用限制了它在臨床上的使用，因而開發(fā)抗腫瘤活性強(qiáng)、毒副作用小的衍生物成為了國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。9-甲氧基喜樹堿（9-Methoxycamptothecin,MCPT），一種喜樹堿衍生物，體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)有明顯的抗多種腫瘤活性，但對(duì)其有關(guān)細(xì)胞和分子方面的機(jī)制研究極少。本課題首先體外評(píng)價(jià)了9-甲氧基喜樹堿的抗腫瘤細(xì)胞活性，并從9-甲氧基喜樹堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響DN
3、A拓?fù)洚悩?gòu)酶活性及其與DNA分子相互作用等三個(gè)方面進(jìn)行了作用機(jī)制的研究。1.評(píng)價(jià)9-甲氧基喜樹堿體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，9-甲氧基喜樹堿抑制7種腫瘤細(xì)胞系，呈劑量依賴性。其中，人卵巢癌細(xì)胞A2780和人宮頸癌細(xì)胞Hela對(duì)9-甲氧基喜樹堿最為敏感，其IC50值分別為79±21nM和151±61nM，明顯低于陽性對(duì)照藥物10-羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）。選取這兩種細(xì)胞系開展后續(xù)作用機(jī)制研究。2.研究了9-甲氧基喜樹堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制。結(jié)果表明：（1）9-甲氧基喜樹堿處理A2780和Hela細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到
4、明顯的早期和晚期凋亡細(xì)胞。9-甲氧基喜樹堿誘導(dǎo)A2780細(xì)胞的早期凋亡和總凋亡率增加具有時(shí)間-劑量依賴性；（2）9-甲氧基喜樹堿處理A2780和Hela細(xì)胞24h后即表現(xiàn)出強(qiáng)的G2/M期阻滯。1×IC50濃度的9-甲氧基喜樹堿處理A2780細(xì)胞24h后對(duì)G2/M期阻滯最明顯，達(dá)到81.93%；（3）9-甲氧基喜樹堿能使A2780和Hela細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧（ROS）明顯增多。A2780細(xì)胞中ROS產(chǎn)生量最高達(dá)到對(duì)照組的5.22倍，Hela細(xì)胞中最高為2.65倍；（4）9-甲氧基喜樹堿能不同程度激活caspase-3，-8和-9。在A2780細(xì)胞中對(duì)caspase-9酶激活程度最強(qiáng)，是對(duì)照組細(xì)
5、胞的15倍。Hela細(xì)胞中caspase-3的酶活性被顯著提高，約為對(duì)照組細(xì)胞的8倍；（5）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到9-甲氧基喜樹堿調(diào)節(jié)了17個(gè)內(nèi)、外源性細(xì)胞凋亡通路及細(xì)胞周期相關(guān)基因。其中對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控基因p21，p27和cyclinE上調(diào)較顯著；且明顯上調(diào)參與外源性細(xì)胞凋亡通路的TNFα、Fas和FasL；同時(shí)還調(diào)節(jié)了主要參與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路的bcl-2家族有關(guān)基因表達(dá)水平；（6）WesternblotI華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文檢測(cè)到TNFα,Fas,P53和P27的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，與其基因水平調(diào)節(jié)一致。綜上所述，9-甲氧基喜樹堿可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，并
6、增加ROS的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)bcl-2家族相關(guān)基因激活caspase-9，從而啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路；同時(shí)激活了caspase-8啟動(dòng)以TNFα和Fas/FasL為主的外源性細(xì)胞凋亡通路。以上兩條通路共同激活caspase-3，最終導(dǎo)致A2780和Hela細(xì)胞凋亡。3.研究了9-甲氧基喜樹堿對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ活性的影響。結(jié)果顯示，100μM的9-甲氧基喜樹堿表現(xiàn)出對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ明顯的抑制作用，與陽性對(duì)照藥物喜樹堿一樣，可使超螺旋DNA產(chǎn)生明顯的缺刻型DNA條帶。不同濃度的9-甲氧基喜樹堿均未表現(xiàn)出對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抑制作用（與陽性對(duì)照藥物依托泊苷相比）。值得注意的是，100μM的9-甲氧基喜
7、樹堿能單獨(dú)作用于超螺旋DNA并產(chǎn)生明顯的缺刻型DNA產(chǎn)物，表明9-甲氧基喜樹堿在沒有拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ存在的情況下也能作用于DNA。提示，9-甲氧基喜樹堿的這種直接結(jié)合DNA的能力很有可能是其抗腫瘤活性強(qiáng)的一種重要機(jī)制。4.采用光譜法研究了9-甲氧基喜樹堿與DNA分子相互作用。結(jié)果表明，（1）紫外-可見吸收光譜顯示，隨著不斷滴加CT-DNA，9-甲氧基喜樹堿最大吸收峰出現(xiàn)了增色效應(yīng)，譜帶未發(fā)生偏移，表明其與DNA的作用屬于外部
