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《沙田柚花柱自交不親和相關(guān)基因的克隆與鑒定 (1)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、第一章綜述1抑制性消減雜交（suppressionsubtractivehybridization，SSH）[1]1996年，Diatchenko等首次報(bào)道了抑制性消減雜交方法。這一方法事實(shí)上是由Clontech公司、加州大學(xué)舊金山分校和俄國科學(xué)院合作研究報(bào)道的，并于1998年由Clontech[1,2]公司將其商品化，開發(fā)成SSH消減文庫構(gòu)建試劑盒。SSH技術(shù)是一種比較和分離不同細(xì)胞系、不同組織或同一細(xì)胞系、同一組織在不同條[3]件下差別表達(dá)基因的方法。經(jīng)過數(shù)年的實(shí)踐運(yùn)用，它已成為一種研究生物的生長、發(fā)育、[4]抗病
2、、抗逆等生命過程相關(guān)基因的差異表達(dá)及克隆的有效途徑。1.1SSH技術(shù)的基本原理SSH的基本原理：利用消減雜交和兩次抑制PCR，使差異表達(dá)基因的cDNA片段得到[4]高度富集，從而實(shí)現(xiàn)對差異表達(dá)基因的分離和克隆。消減雜交運(yùn)用了雜交二級動力學(xué)原[5]理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA，從而在雜交過程中，使豐度高的單鏈cDNA雜交形成雙鏈，在雜交完畢后，原來在豐度上有差別的單鏈cDNA達(dá)到基本一致。抑制PCR是利用DNA鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，且比鏈間退火更穩(wěn)定的動力學(xué)特性，使非目的
3、系列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似[4]“鍋柄”的結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的基因序列片段的擴(kuò)增。具體過程如下（見附錄圖1和2）：⑴cDNA的合成與酶切：抽提兩種不同來源（檢測子tester和驅(qū)動子driver）的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。將tester和driver雙鏈cDNA分別用RsaI或AfaI等四堿基識別4酶酶切為較短的平頭末端。理論上這些酶在每4=256bp處就有一個(gè)酶切位點(diǎn)，因此雙鏈cDNA經(jīng)酶切后可產(chǎn)生許多個(gè)小片段。這些小片段可以降低雜交過程中形成的復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)對雜交的阻
4、礙作用，小片段的形成還為單個(gè)基因提供了更好的代表性，從而增加檢出差[4,6]別表達(dá)基因的可能性。⑵接頭連接：將酶切后的tester產(chǎn)物分成兩等份，一份與接頭1連接，另一份與接頭2R連接，而driver則不進(jìn)行接頭連接。接頭是由一長鏈（約40余個(gè)核苷酸）和一短鏈（約10個(gè)核苷酸）組成的一端是平端的雙鏈DNA片段，其末端均設(shè)計(jì)為沒有磷酸基團(tuán)，以便于長鏈的3’端與cDNA的5’端共價(jià)結(jié)合。接頭長鏈外側(cè)序列（22bp）與第一次抑制PCR[4]引物相同，內(nèi)側(cè)序列（約20bp）與第二次抑制PCR引物相同。⑶第一次消減雜交：分別向連
5、接好不同接頭的testercDNA中加入過量的drivercDNA進(jìn)行不充分雜交。tester與driver序列相同的片段形成雙鏈片段，而留下各自有差別表達(dá)的片段，從而使testercDNA單鏈均等化，即有豐度差別的cDNA相對含量大體相等。根據(jù)復(fù)性動力學(xué)原理，濃度高的單鏈分子迅速復(fù)性，而濃度低的單鏈分子仍以單鏈形式存在，在不充分雜交后，各種單鏈分子在濃度上基本相同，達(dá)到均一化高豐度表達(dá)基因的cDNA的作用。另外，由于testercDNA和drivercDNA中序列相同的片段形成了異源雙鏈分子，1使testercDNA
6、單鏈中的差別表達(dá)基因的目標(biāo)cDNA得到顯著富集。雜交完成后將形成四種產(chǎn)物：a，均一化了的差異表達(dá)的單鏈testercDNA；b，自身退火的testercDNA；c，異源退火的tester/drivercDNA（共有序列的異源雜交產(chǎn)物）；d，自身退火的drivercDNA及[4]單鏈drivercDNA。⑷第二次消減雜交：將第一次雜交的兩份產(chǎn)物混合，并加入新變性的drivercDNA，進(jìn)行第二輪消減雜交，以進(jìn)一步去除共有序列。此時(shí)，只有第1次雜交后的經(jīng)均等化和扣除的單鏈testercDNA可與drivercDNA結(jié)合形成
7、雜交雙鏈和一種新的e型雜交雙鏈。e型雜交雙鏈?zhǔn)怯蛇B接有不同接頭的差異表達(dá)單鏈testercDNA片段退火形成的。正由于這兩個(gè)不同的接頭，使其能在以后的PCR中有效地以指數(shù)形式擴(kuò)增，進(jìn)一步富集了在tester和[4]driver樣本之間所存在的那些有差別表達(dá)的序列片段。⑸第一次抑制PCR：消減雜交完成后，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)前，應(yīng)先用DNA聚合酶將cDNA鏈接頭上的粘性末端補(bǔ)齊，然后加入根據(jù)接頭長鏈序列設(shè)計(jì)的外側(cè)引物，進(jìn)行第一次抑制PCR擴(kuò)增。a,b,c,d,e五類分子在PCR反應(yīng)中具有不同的表現(xiàn)：a為一端帶接頭的單鏈，d為
8、兩端都不帶接頭，a,d兩類分子因無引物結(jié)合位點(diǎn)不能擴(kuò)增；c類是帶有一端相同接頭的雙鏈，只能線性擴(kuò)增；b類分子兩端具有相同接頭，在PCR反應(yīng)的變性和復(fù)性過程中，長的末端反向重復(fù)序列容易分子內(nèi)自我復(fù)性形成“鍋柄”樣（panhandle-like）結(jié)構(gòu)，阻抑了PCR擴(kuò)增，這便是抑制PCR作用（如附錄圖2所示）；只有目標(biāo)片段形成的e[4]
