百合aco基因的克隆及原核表達(dá)分析

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1、2百合ACC氧化酶基因的克隆及原核表達(dá)分析中所受的影響，首次將百合歸為不敏感或較敏感【6】。Elgar等r7】在研究東方百合、亞洲百合對(duì)乙烯敏感度時(shí)也提出了類似的觀點(diǎn)。他們認(rèn)為在切花瓶插過程中，產(chǎn)生的乙烯非常少或幾乎無法檢測(cè)出來，并且只有當(dāng)花瓣萎蔫時(shí)才能發(fā)現(xiàn)乙烯的存在。但是大多數(shù)研究表明，乙烯會(huì)縮短百合切花的壽命【8-9l。乙烯對(duì)切花的作用與結(jié)合組織部位有關(guān)、與組織敏感性有關(guān)【l們，不同的敏感性還與組織將乙烯氧化為有活性的代謝物的能力，以及催化這些反應(yīng)的酶【111。根據(jù)開花衰老過程中花卉乙烯的大量生成與否，可將花卉劃分為躍變型和非躍變型兩大類【121。百合切花花朵乙烯釋放

2、量屬于哪種類型，迄今仍未明確。有人研究百合花朵的不同發(fā)育期與乙烯釋放量、呼吸強(qiáng)度變化情況，發(fā)現(xiàn)百合花朵的乙烯釋放量和呼吸強(qiáng)度變化趨勢(shì)基本一致，屬于乙烯末期上升型花卉【13】。楊秋生等【9】研究認(rèn)為常溫下亞洲雜種百合Gencve切花內(nèi)源乙烯釋放量的變化與躍變型果實(shí)晚熟過程類似：低溫下內(nèi)源乙烯釋放量始終未出現(xiàn)明顯的高峰，這說明乙烯不是衰老的啟動(dòng)因子，而只在一定程度上加快衰老的進(jìn)程。研究證明，部分乙烯釋放型百合花卉，花朵開放時(shí)，伴隨著乙烯釋放而衰老。乙烯是其內(nèi)源的衰老激素，花瓣衰老的最初反應(yīng)之一便是自動(dòng)催化而產(chǎn)生乙烯，一方面衰老過程中產(chǎn)生乙烯，另一方面是產(chǎn)生的乙烯又激活與衰老有

3、關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)衰老，并導(dǎo)致花朵最終凋謝變質(zhì)。百合花的衰老受乙烯的誘導(dǎo)，主要是由于乙烯能誘導(dǎo)花瓣半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)，該酶對(duì)膜脂的脫脂作用使得膜的完整性發(fā)生變化，從而啟動(dòng)其花瓣的衰老。因此控制百合切花乙烯的生物合成，是延緩切花的衰老、延長其保鮮期的一條主要途徑。1．2ACC氧化酶(ACO)基因的研究進(jìn)展1．2．1ACO基因克隆的研究進(jìn)展ACO是乙烯合成途徑中的最后一個(gè)酶，此酶最早被№g及其同事定名為乙烯形成酶，直到90年代初，這個(gè)酶的反應(yīng)特征才被闡明。由于ACO需要抗壞血酸和氧作為輔助底物，且需要Fc2+和C02作為輔助因子，因此把EFE稱為ACC氧化酶更合適。AC

4、O的鑒定遠(yuǎn)比Acs困難的多，因?yàn)椴荒苡猛ǔ５纳锘瘜W(xué)方法分離出細(xì)胞提取液中的ACO；但是，采用分子克隆的辦法來鑒定ACO，可以克服直接從植物組織中提取Aco的困難，這使ACO的研究柳暗花明。雖然不能用傳統(tǒng)的生化方法分離出這個(gè)酶，但是可以鑒定與成熟有關(guān)的cDNA的功能性表達(dá)。Gderson等(1985)從不同成熟階段的番茄中分離了AcO的mI斟A，并使其在兔網(wǎng)狀細(xì)胞裂解液系統(tǒng)中翻譯。用SDS．PAGE分析翻譯產(chǎn)物，他們發(fā)現(xiàn)有4．8個(gè)翻譯產(chǎn)物的水平在成熟過程中提高，其中一個(gè)是PG，而其他的功能未知【14】。S1ater等提取了成熟時(shí)的番茄p01y(A)+對(duì)叮A，建立了cDNA

5、文庫【15】。用綠熟期和完全成熟期番茄果實(shí)的cDNA作為探針進(jìn)行差異雜交篩選，用此方法鑒定與成熟有關(guān)的cDNA克隆，其中有6個(gè)克隆編碼的多肽，其分子量與例erS0n體外翻譯的結(jié)果研究一致。將其中一條編碼35kDa蛋白第一章文獻(xiàn)綜述3的克隆命名為pTOMl3，在番茄成熟過程中的綠熟期果實(shí)及葉受傷后，編碼35kDa的蛋白質(zhì)的m砌妊的出現(xiàn)與乙烯的合成量相一致。用pToMl3作為探針在成熟、損傷及未成熟的果實(shí)及受傷的葉片的對(duì)蛆中篩選出的mRNA，體外翻譯時(shí)同樣產(chǎn)生35kDa的蛋白，但在未受傷的果和葉中，卻未得到相應(yīng)的蛋白。于是Smitll等提出，pToMl3可能是一個(gè)與乙烯生物合

6、成有關(guān)的酶。‰g等最初試圖在酵母中表達(dá)pTOMl3，但未成功，因?yàn)閜TOMl3插入片段的5’端缺少了2個(gè)堿基，故mIⅢA不能翻譯，經(jīng)過修正的cDNA克隆導(dǎo)入酵母，成功表達(dá)了ACO的活性，從而證實(shí)pTOMl3翻譯的產(chǎn)物是ACO。表1．1從植物中已克隆到的ACO部分基因1'able1—1ACOg∞e舶mdi儂氍ntpl姐t除了番茄外，也相繼從其他多種植物中克隆了ACO基因(表1．1)，還有黃杉【16】、康乃馨【171、甘蔗【1引、仙人掌【191、哈密瓜【201、白蘭瓜【211等。1．2．2ACO基因表達(dá)的研究進(jìn)展1．2．2．1Aco基因表達(dá)的誘導(dǎo)因子植物ACO基因的表達(dá)受激素

7、、環(huán)境協(xié)迫、植物的生育過程等誘導(dǎo)。乙烯處理誘導(dǎo)了擬南芥、蝴蝶蘭、網(wǎng)紋甜瓜、碧冬茄、青花菜等ACO基因的表達(dá)；ABA則誘導(dǎo)青花4百合ACC氧化酶基因的克隆及原核表達(dá)分析菜ACOXl和ACO)(2的表達(dá)【列。NaCl處理能誘導(dǎo)蝴蝶蘭AC01的表達(dá)；而L～A可誘導(dǎo)黃瓜ACO基因的表達(dá)。最近的研究表明，LAA能誘導(dǎo)乙烯的增加主要是通過乙烯自身誘導(dǎo)了AcO基因的轉(zhuǎn)錄口3J；同時(shí)ACO基因?qū)C(jī)械傷害、澤水、臭氧、病原體侵染、光溫、干旱等環(huán)境協(xié)迫有應(yīng)答。如傷刺激誘導(dǎo)花椰菜ACCOXl和ACCo)(2、番茄Ac01、網(wǎng)紋甜瓜ACol、桃ACO