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《l-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterBuildingofengineeringbacteriastoproduceL—PhenylalanineandoptimizingthefermentationconditionsofthestrainsByKunyangHuangSupervisor：XuelingRenParmaceuticalAnalysisSchoolofPHarmaceutialScienceMay，2012原創(chuàng)
2、性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者：瓚葉次．‘．日期．如臟年多月加日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查
3、閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者苡砷央日期：≯肛年∥月陽(yáng)日L摘要苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)在醫(yī)學(xué)、食品加工及飼養(yǎng)添加劑領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)企業(yè)的供應(yīng)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)口益增長(zhǎng)的需求量。因此，應(yīng)用代謝_L程的方法構(gòu)建L一苯丙氨酸高產(chǎn)菌株，降低
4、生產(chǎn)成本，對(duì)減少我國(guó)L一苯丙氨酸進(jìn)口，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。選取大腸桿菌L一苯丙氨酸合成路徑上的關(guān)鍵酶甘油激酶(glpK基因編碼)和3一磷酸甘油脫氫酶(glpD基因編碼)，PCR克隆glpK與glpD基因后，將它們分別與載體pAF(C)、pZA31連接，得到載體pAF(C)D、pAF(C)KI、p31K；然后分別改變載體pAF(C)KI的啟動(dòng)子序列和基因glpK基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列(RBS序列)獲得載體pAF(L)K與pAF(C)KII。將一個(gè)或兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化入EcohMG△中，構(gòu)建工程藺厘coh
5、MG／xpAF(C)D、最coJlMG△pAF(C)ZI、Ec0111dG△pAF(L)KI、￡cohMG／xpAF(C)KII、EcohMGAp31K—pAF(C)、點(diǎn)cohMGApAF(C)KII—p31PT，首次實(shí)現(xiàn)了基因glpK與pheA和aroF，基因glpD與pheA和aroF，glpK與pheA、aroF、ppsA和tktA的共表達(dá)。將構(gòu)建的工程菌做SDS-PAGE電泳，glpK和glpD基岡在相應(yīng)工程菌巾均有表達(dá)，即在蛋白電泳凝膠上預(yù)期位置56．231KD處(glpK)和56．751KD處
6、(glpD)有表達(dá)條帶。工程蔭在250ml的燒瓶中，37℃、240rpm／min條件下，分別以15g／L葡萄糖和10g／L甘油為碳源進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示，工程菌在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中L一苯丙氨酸產(chǎn)量顯著高于以葡萄糖為碳源時(shí)的產(chǎn)量，菌株EcohMGApAF(C)KII的L-Phe產(chǎn)生能力較強(qiáng)。以10g／L甘油為碳源發(fā)酵48h后，工程菌Ecoh'MGApAF(C)KII的L-苯丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到3．43g／L，是同條件下對(duì)照菌株最cohMGApAF(C)產(chǎn)酸量的3．33倍，是空白菌株EcohMGAL-Phe產(chǎn)量的
7、62．36倍，說(shuō)明glpK基閃的表達(dá)達(dá)到了增加終產(chǎn)物L(fēng)-Phe的目的。以EcolzMGApAF(C)KII為研究對(duì)象，進(jìn)一步的發(fā)酵條件優(yōu)化后，結(jié)果顯示，大腸桿菌最適生長(zhǎng)溫度37℃條件下，增加發(fā)酵時(shí)問(wèn)、增加發(fā)酵過(guò)程巾的通氣量有利于上程菌L-Phe的產(chǎn)出：在37℃、240rpm／min條件下，EcollMG／kpAF(C)KII在500ml搖瓶中發(fā)酵48h后L_Phe產(chǎn)量達(dá)到了3．94g／L。本研究構(gòu)建的￡cohMGZXpAF(C)ZII菌株，實(shí)現(xiàn)了在我們前期工作基礎(chǔ)上摘要L-Phe產(chǎn)量的進(jìn)一步提高，為后續(xù)_
8、L作中L-Phe高產(chǎn)菌株的構(gòu)建起到一定的啟示作用。關(guān)鍵詞：L一苯丙氨酸發(fā)酵葡萄糖甘油碳源核糖體結(jié)合位點(diǎn)ⅡAbstractPhenylalanineiswidelyusedintheproductionofmedicine,foodandfeedaddictives．Butnow,thepracticalyieldofPhenylalaninefromdomesticenterpriseCanneverevermeetthein
