基因工程菌發(fā)酵

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1、第八章發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的應(yīng)用第一節(jié)基因工程菌發(fā)酵第一節(jié)基因工程菌發(fā)酵一、基因工程基本知識(shí)基因工程(geneticengineering)的定義基因工程是在分子水平上進(jìn)行的遺傳操作，指將一種或多種生物體(供體)的基因或基因組提取出來．或者人工合成基因，按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，經(jīng)過體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體(受體)的細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。又稱重組DNA技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。工程菌的應(yīng)用1、基因藥物例如，紅細(xì)胞生成素、胰島素、干擾素、乙肝疫

2、苗、生長激素和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。2、其它發(fā)酵產(chǎn)品例如酶制劑、氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）、抗生素等?；蚬こ痰幕静襟E目的基因獲得表達(dá)載體構(gòu)建基因的導(dǎo)入鑒定核酸鑒定：PCR;SouthernandNorthernblot.蛋白鑒定：SDS-PAGE;HPLC;Westernblot.功能檢測：機(jī)體生理生化功能、性狀的改變。原核:包涵體,分泌型真核:穿梭質(zhì)粒文庫合成PCR基因組文庫cDNA文庫細(xì)菌：氯化鈣；電穿孔;細(xì)胞：磷酸鈣；脂質(zhì)體；電穿孔；微注射；V動(dòng)物：微注射；電穿孔；精子；ESC；RT-V載體質(zhì)粒(plasmi

3、d)粘粒(cosmid)λ噬菌體(λphage)重組子的形成（一）載體載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制。1、能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。2、要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites，MCS）。3、有適合的標(biāo)記（抗藥性基因），易于選擇。作為基因工程的載體，必須具備以下幾個(gè)性能：其他條件：分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。有時(shí)還要求載

4、體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.co

5、li環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征（二）載體DNA與外源基因片段的連接1、黏性末端

6、DNA分子之間的連接2、平末端DNA片斷的連接（1）T4DNA連接酶（2）用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法同聚物加尾法用5’末端特異的核酸外切酶處理DNA片斷在A和B分別中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40個(gè)堿基末端轉(zhuǎn)移酶同聚物加尾法或T4連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。銜接物連接法銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶

7、切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A銜接物連接法雙銜接物連接法的基本程序cDNA鏈的合成通過DNA聚合酶合成第二鏈加入SalI銜接物SI核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物EcolI優(yōu)點(diǎn)：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。在用DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆DNA的片斷或基

8、因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。DNA接頭（adapter）連接法：1978年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。粘性末