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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文rhG--CSF對大鼠急性缺血再灌注腦損傷后Survivin、Egr--1表達(dá)及血管再生的影響姓名：程鶴云申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：滕軍放201204摘要rhG．CSF對大鼠急性缺血再灌注腦損傷后Survivin、Egr-1表達(dá)及血管再生的影響中國已于1999年進(jìn)入老齡化社會(huì)，老年人口的增長，致使一系列老年病如缺血性腦血管意外逐年增多。此類疾病發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率均很高，成為嚴(yán)重危害著人類生命健康的三大主要疾病之一，給家庭、社會(huì)帶來沉重的負(fù)累。腦微血管在維持神經(jīng)元的穩(wěn)定方面起重要作用：腦缺血性損傷時(shí)，隨缺血時(shí)
2、間的延長，微血管的數(shù)量逐漸增加。研究表明缺血半暗帶血管微密度增加的患者存活率高，故缺血后血管再生的情況與腦血管病的進(jìn)展轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，故研究急性腦損傷后血管再生也成為重點(diǎn)所在。粒細(xì)胞集落刺激因子(OranulocyteColonyStimulatingFactor，G．CSF)是由Metcalf等科學(xué)家于1980年第一次發(fā)現(xiàn)的一種存在于人體內(nèi)的多肽鏈的細(xì)胞生長因子，具有特異性調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)粒細(xì)胞功能及對機(jī)體防御應(yīng)激功能。G．CSF．R存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，這提示G．CSF在在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)方面起著一定的保護(hù)機(jī)制作用，故其在神經(jīng)修復(fù)與再生
3、，神經(jīng)系統(tǒng)受損保護(hù)領(lǐng)域受到越來越廣泛的關(guān)注，其作用于神經(jīng)系統(tǒng)的主要機(jī)制有抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)源性骨髓干細(xì)胞遷徙至受損部位，與特定的內(nèi)因子共同作用下進(jìn)行增殖，分化為新生的神經(jīng)元細(xì)胞、拮抗炎癥反應(yīng)、阻斷興奮性氨基酸毒性以及促進(jìn)血管生成等。血管新生是以出芽方式在原有血管基礎(chǔ)上形成新的毛細(xì)血管的過程，其核心是血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖。Survivin可調(diào)控Caspase．3等凋亡因子的表達(dá)，是重要的抗凋亡因子，近來血管平滑肌上，體外立體管腔內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)新生毛細(xì)血管上均發(fā)現(xiàn)Survivin強(qiáng)烈表達(dá)，抑制Survivin的表達(dá)可抑制血管生成，強(qiáng)制表達(dá)則促血管內(nèi)皮
4、發(fā)生，提示其在新生血管形成的過程中發(fā)揮著重要的作用。Egr-1的功能主要表現(xiàn)在參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控多種基因的表達(dá)，包括生長因子基因、信號(hào)傳導(dǎo)基因、轉(zhuǎn)錄因子基因和癌基因等，對細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和損傷修復(fù)起重要作用，也可調(diào)控促血管形成因子，促進(jìn)血管生成。Survivin發(fā)揮促進(jìn)這些因子的表達(dá)及分泌的功能時(shí)，需要轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的參與，同時(shí)survivn又可在一定范圍影響Egr-1的表達(dá)和作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷MCAO模型，觀察大鼠腦缺血再灌摘要注后額葉、顳葉缺血半暗帶Egr．1、Survivin和微血管生成的變化，分析Egr．1與S
5、urvivin、之間可能存在的相關(guān)關(guān)系；以及重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinanthumanGranulocyteColonyStimulatingFactor，G．CSF)對前述二者的影響，探討重組人粒細(xì)胞集落刺激因子在神經(jīng)保護(hù)方而的可能機(jī)制，以期為rhG．CSF臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥方法2．3月齡，質(zhì)量280．3209封閉群健康雄性清潔級Sprague．Dawley(SD)大鼠72只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將參與實(shí)驗(yàn)SD大鼠參照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法隨機(jī)選入假手術(shù)組(A)，缺血再灌注損傷+生理鹽水對照組(模型組)(B
6、)與缺血再灌注損傷+G．CSF給藥組(治療組)(C)(n=24)，各組根據(jù)處死時(shí)間不等又分為7d組，14d組和21d組，每亞組入選8只。入選治療組大鼠自2h后白腹部皮下注射G．CSFSOpg／(kg·d)，單次注射量7．5ml，連續(xù)用藥。MCAO模型制備、標(biāo)本檢測采用改良的Longa線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取腦組織常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、制成切片。采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，觀察各組Survivin、Egr-1與CD31指示的缺血半暗帶微血管表達(dá)的變化。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測量陽性區(qū)積分光密度值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采
7、用SPSS17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間陽性細(xì)胞數(shù)的比較用單因素方差分析及LSD—t檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)間陽性細(xì)胞數(shù)的比較采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)Q--=0．05，雙指標(biāo)相關(guān)性采用pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果Surviving表達(dá)．局灶性缺血再灌注后Survivin陽性細(xì)胞于假手術(shù)組數(shù)量稀少，排列稀疏，染色淺淡，模型組及治療組表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多，主要表達(dá)在神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿，有少數(shù)胞核也有表達(dá)，特別是血管增生活躍部分陽性細(xì)胞明顯增加，模型組各時(shí)間點(diǎn)Survivin均較假手術(shù)組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0．05)，治
8、療組再灌注14d時(shí)達(dá)高峰，7d，14天時(shí)間點(diǎn)Survivin表達(dá)均較模型組明顯增
