不同極化的巨噬細(xì)胞在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究

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1、分類號：R567.3學(xué)校代碼：10062密級：學(xué)號：20071027博士學(xué)位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：不同極化的巨噬細(xì)胞在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究TITLEEffectofDifferentPolarizedMacrophagesonInvasivenessandMetastasisinHepatocellularCarcinoma一級學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級學(xué)科：外科學(xué)普通外科學(xué)論文作者：葛勇勝指導(dǎo)教師：許戈良天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O一二年五月萬方數(shù)據(jù)分類號：R567.3學(xué)校代碼：10062密級：學(xué)號：20071027學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位√專業(yè)學(xué)位學(xué)科

2、門類：醫(yī)學(xué)博士學(xué)位論文DOCTORALDISSERTATION論文題目：不同極化的巨噬細(xì)胞在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究TITLEEffectofDifferentPolarizedMacrophagesonInvasivenessandMetastasisinHepatocellularCarcinoma一級學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級學(xué)科：外科學(xué)普通外科學(xué)論文作者：葛勇勝指導(dǎo)教師：許戈良導(dǎo)師組成員：李建生等天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二O一二年五月萬方數(shù)據(jù)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方

3、外，論文中不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫。保密，在年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密√√（請在相對應(yīng)的方框內(nèi)打“√”）√√學(xué)位論文作者簽名：√日期：年月日√導(dǎo)師簽名：日期：年月日√萬方數(shù)據(jù)

4、天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要第一部分目的分離獲得單核細(xì)胞，進(jìn)而極化成不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，研究不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷徙、促血管生成能力的影響。方法應(yīng)用梯度離心的方法分離外周血單核細(xì)胞，通過不同極化劑極化單核細(xì)胞成不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞。遷徙實(shí)驗(yàn)中，將不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上清液加至腫瘤細(xì)胞中，24小時后觀察細(xì)胞生長趨勢，判斷不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對腫瘤遷徙能力的影響；侵襲實(shí)驗(yàn)中，將肝癌細(xì)胞在Transwell體系中與不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，指定時間內(nèi)觀察穿透基質(zhì)膠進(jìn)入下室的肝癌細(xì)胞的數(shù)量；將不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上清液與不同肝癌細(xì)胞進(jìn)行共

5、培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)體系中腫瘤細(xì)胞中VEGF（PCR,WB檢測）的表達(dá)情況。結(jié)果在遷徙實(shí)驗(yàn)中，相同時間內(nèi)，與M2型巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞較與M1型巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞和空白對照組肝癌細(xì)胞遷徙能力明顯增強(qiáng)。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，與M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞較與M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲力。增殖方面，與不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞的上清液共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞較M1型巨噬細(xì)胞更能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。促血管生成方面，M2型巨噬細(xì)胞較M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)共培養(yǎng)體系中VEGF-A的表達(dá)更強(qiáng)(Western-Blot,RT-PCR)；同時MMP-9（金屬

6、基質(zhì)蛋白酶-9）的表達(dá)在M2共培養(yǎng)體系中較M1共培養(yǎng)體系中強(qiáng)(Western-Blot,RT-PCR)，兩組較單獨(dú)肝癌細(xì)胞對照組的表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論M2型巨噬細(xì)胞較M1型巨噬細(xì)胞更能促進(jìn)肝癌惡性轉(zhuǎn)化。第二部分目的本研究對TAMs進(jìn)行分型分析，擬探討不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對肝癌病人預(yù)后的影響。方法分別對巨噬細(xì)胞兩種類型（M1,M2）進(jìn)行間接免疫熒光染色(CD68+HLA-DR+,CD68+CD163+)，聯(lián)系病人術(shù)后隨訪資料及臨床病理指標(biāo)，繪制生存曲線，分析不同類型的巨噬細(xì)胞對肝癌病人預(yù)后的影響。結(jié)果免疫熒光結(jié)果分析結(jié)合Cox風(fēng)險回歸模型分析顯示，M2型巨噬細(xì)胞是肝癌病人獨(dú)立的預(yù)后不

7、良因素，與病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。將M2的密度中位值作為高、低組的分界點(diǎn)，生存曲線顯示M2型低表達(dá)組有著更長的生存預(yù)后時間的和更高的生存率。結(jié)論M2型巨噬細(xì)胞是肝癌病人的不良預(yù)后因素，M2型巨噬細(xì)胞較M1型巨噬細(xì)胞更能促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。第三部分目的探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮生長因子-A、金屬基質(zhì)蛋白I萬方數(shù)據(jù)天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文酶-9、核因子-κBp50之間的關(guān)系。方法對肝癌病理標(biāo)本進(jìn)行巨噬細(xì)胞、金屬基質(zhì)蛋白酶-9、血管內(nèi)皮生長因子-A、核因子-κB進(jìn)行免疫組化染色，分析與巨噬細(xì)胞表達(dá)