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1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文雞源志賀菌的分離鑒定、IpaC基因的克隆、原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備姓名：苗銀萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：許蘭菊201206河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士研究生論文中文摘要志賀菌是人類感染性腹瀉的主要病原體之一，也可感染人以外的靈長(zhǎng)類動(dòng)物。以往人們認(rèn)為志賀菌不感染畜禽，事實(shí)上，國(guó)內(nèi)外大量的資料表明志賀菌可感染豬、牛、兔、鴨、雞等畜禽，并可引起它們發(fā)病甚至死亡。雞志賀菌病是近些年發(fā)現(xiàn)的急性傳染病。該病流行廣泛，危害嚴(yán)重，可引起不同品種、不同日齡的雞發(fā)生腹瀉，并可導(dǎo)致雛雞死亡，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。又因志賀菌可能在
2、人禽間造成交互感染，這就給人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重隱患。因此，對(duì)雞志賀菌病展開(kāi)研究不但具有重要的獸醫(yī)衛(wèi)生學(xué)意義，而且具有重大的醫(yī)學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究以采集的腹瀉雞病料為材料進(jìn)行志賀菌的分離，之后克隆、分析雞源志賀菌IpaC基因，最后原核表達(dá)IpaC蛋白并制備該蛋白的多克隆抗體。具體研究結(jié)果如下：1．通過(guò)分離培養(yǎng)、抹片鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)腹瀉雞病料進(jìn)行志賀菌的分離鑒定。結(jié)果顯示：從駐馬店腹瀉雞心血中分離出1株志賀菌；該茵致病性較強(qiáng)，攻毒組雛雞發(fā)病率為100％(10／10)、病死率為50％(5／10)，臨床表現(xiàn)為病雞拉血便，重者膿血痢；病(死
3、)雞剖檢可見(jiàn)腸壁變薄、有出血斑，肝臟腫大出血，肺出血、淤血，脾臟出血，腎腫大；鏡檢可見(jiàn)腸道、肝臟、脾臟、肺臟有明顯病變，具體表現(xiàn)為腸粘膜上皮細(xì)胞壞死脫落，腸絨毛結(jié)構(gòu)崩解，固有層出血，腸腺萎縮，肝臟中央靜脈及竇狀隙擴(kuò)張淤血，脾竇淤血，肺泡、支氣管、呼吸性支氣管淤血。2．根據(jù)GenBank上發(fā)表的人源志賀菌IpaC基因ORF兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用PCR方法從ZMD-01株雞源志賀菌毒力質(zhì)粒上擴(kuò)增出IpaC基因片段并成功克隆到pMDI8．T載體后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：與人源志賀菌相比，發(fā)現(xiàn)僅存在2個(gè)堿基突變，757位T變?yōu)镃，936位G變?yōu)锳，757位的突變使
4、精氨酸變?yōu)楦拾彼?，?duì)蛋白的表達(dá)沒(méi)有太大的影響；。志賀菌不同分離株的IpaC基因的同源性很高，核苷酸序列同源性在97．30／0-99．9％之間，其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性在96．2％．99．7％Z問(wèn)，其中，雞源志賀菌IpaC基因與日本株福氏志賀菌X15319的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性最高，同源性分別為99．8％、99．7％，與美國(guó)株鮑氏志賀菌CP001062的核苷酸序列的同源性最低，為97．3％，與美國(guó)株鮑氏志賀菌CP001062和澳大利亞株痢疾志賀菌AY206439IpaC基因推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性最低，為96．4％；分離株ZMD-01株雞源志賀菌
5、與參考株AL391753相似性較大，它們?cè)谕粋€(gè)分支上。3．將ZMD-01株志賀菌IpaC基因克隆至載體pET32a(+)中，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)-IpaC。然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)qb，以IPTG作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS—PAGE試驗(yàn)結(jié)果表明成功表達(dá)IpaC重組蛋白。該重組蛋白分子量約為63kDa，經(jīng)薄層凝膠光密度掃描分析，目的蛋白占菌體總蛋白的21％。對(duì)誘導(dǎo)前菌液培養(yǎng)時(shí)間、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間這三個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳培養(yǎng)條件：將含重組表達(dá)質(zhì)粒河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士研究生論文pET32a-IpaC的B
6、L21(DE3)菌液培養(yǎng)3h(OD值約為O．6)加入終濃度為1．0mM的IPTG，誘導(dǎo)4h時(shí)目的蛋白的量最大。大量表達(dá)目的蛋白后裂解細(xì)菌，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示目的蛋白既存在于上清中，也存在包涵體中。上清液直接經(jīng)Ni-AgaroseHis標(biāo)簽純化試劑盒純化后純度可達(dá)90％以上。WesternBlot分析顯示，重組蛋白與ZMD-01株陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。純化的重組蛋白免疫公雞，血清最高效價(jià)可達(dá)1：12800，說(shuō)明該蛋白具有良好的免疫原性。關(guān)鍵詞：雞源志賀菌；分離鑒定；IpaC基因；克隆測(cè)序；原核表達(dá)；多克隆抗體制備2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)201
7、2屆碩士研究生論文IsolationandIdentificationofShigellafromChickenandClone、ProkaryoticExpressionandPolyclonalAntibodyPreparationofIpaCgene．．．Supervisor：Prof．XuLanjuMasterCandidate：MiaoYinp噸‘．Shigellaeareoneofthemostimportantpathogenswhichcauseinfectiousdiarrheainhuman．Theycanalsoinfectprimates
8、(excepthuman
