雞cvh基因截取片段的克隆、原核表達(dá)及其多克隆抗體制備

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4、取得的研究成果，論文不包含任。除已特別加Ｗ標(biāo)注和致謝的地方外何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大學(xué)或其它單位的學(xué)位而使用過(guò)的材料一。與我同工作的同事對(duì)本論文的研究工作所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確說(shuō)明。本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬?gòu)V西大學(xué)。本人授權(quán)廣西大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即：學(xué)校有權(quán)保存并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢

5、索和傳播，可Ｗ采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于：在年解密后適用授權(quán)。保密。＂＂請(qǐng)?jiān)谏舷鄳?yīng)方框內(nèi)打Ｖ（）論文作者簽名；日期：諫Ｃ＇（ｊ指導(dǎo)教師簽名；矣日期：Ｗ作者聯(lián)系電話：電子郵箱：廣巧大＃項(xiàng)去單化化文巧Ａ因化取々？戰(zhàn)巧克隆ＣＶＨ、化巧表達(dá)及其多義巧化化巧伽備巧ＣＶＨ基因ｆｔ取片段的克Ｋ、原孩表遠(yuǎn)及其多克Ｋ抗體制備巧要ＣＶＨ（Ｃｈｉ濁ｅｎＶＡＳＡＨｏｍｏｌｏｇ）基因是ＶＡＳＡ基因的同源基因，其表達(dá)的Ｃｖｈ蛋白含有ＤＥＡＤ－ｂ

6、ｏｘ保守基ＲＮＡ解序，具有旋酶活性，在生殖系細(xì)胞中特異性存在，對(duì)配子的形成起著決定性的作用。因此，ＣＶＨ基因作為生殖系細(xì)胞的標(biāo)志基因，在巧胎干細(xì)胞（ＥＳ）和原始生殖細(xì)胞（ＰＧＣ）的研究中用于鑒別和篩選生殖系細(xì)胞。－本研究旨在通過(guò)克隆雞ＣＶＨ基因的片段，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得曲ｓＣｖｈ融合蛋白，純化后作為抗原免疫新西蘭大白兔制備抗ＣＶＨ基因的多克隆抗體。利用Ｔｒｉｚｏｌ法提?。持荦g的雞睪丸中的總ＲＮＡＲＴ－ＰＣＲＣＶＨ基因６４０ｂ，用擴(kuò)増中ｐ的編碼序列，并－ＳＴ載體上構(gòu)建－Ｔ－ＣＶＨ重組質(zhì)粒將其克隆

7、到ｐＭＤｌＰＭＤ１８。經(jīng)鑒定序列正確的陽(yáng)性質(zhì)－－－，將其插入的目的基因亞克隆至ＥＴ３０ａ表達(dá)載體上粒ｐ，構(gòu)建ｐＥＴ３０ａＣＶＨ重組質(zhì)粒，－ＤＥ３－經(jīng)雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ＥｃｏｆｔＢＬ２１，用１ｍｍｏｌ／Ｌ異丙基硫代Ｄ（）Ｐ半乳糖‘０１－甘（巧了）３７。直溫下誘導(dǎo)４１１．，使其表達(dá)目的蛋白？乂０５與＼￥６８１６〇１６１〇＊檢，用８０３測(cè)和鑒定目的蛋白的表達(dá)。確定目的蛋白表達(dá)后８ｍｏｌ／－，用Ｌ尿素溶解蛋白，通過(guò)ＮｉＮＴＡ－Ｃｖｈ親和層析柱對(duì)出ｓ融合蛋白進(jìn)行純化。得到的純化蛋白與弗氏佐劑混合乳

8、化后，分三次皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔、，每次間隔３周。于第Ｈ次注射后第７天，也臟采血后收集血清，該血清即為制備的抗ＣＶＨ基因多克隆抗體。最后通過(guò)分離的第５．５天的雞胚生殖崎作為抗原，通過(guò)Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測(cè)Ｃｖｈ多克隆抗體的特異性。結(jié)果表明；（１）本實(shí)驗(yàn)克隆了雞ＣＶＨ基因ＯＲＦ框中的６４０ｂｐ編碼片段