opg調(diào)控破骨細胞nf-κb通路的研究

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1、OPG調(diào)控破骨細胞NF．10B通路的研究TheregulationofOPGonNF--loBpathwayinosteoclast研究生：王世濤指導教師：劉宗平教授揚州大學獸醫(yī)學院I臨床獸醫(yī)學內(nèi)科實驗室2012．5王世濤OPG調(diào)控破骨細胞NF．Id3通路的研究OPG調(diào)控破骨細胞NF．Id3通路的研究中文摘要機體維持骨組織不斷更新，保持生命活力是依靠骨代謝完成的。骨代謝平衡一旦被打破，機體便會出現(xiàn)各類代謝性骨病，其中骨營養(yǎng)不良性疾病如骨質(zhì)疏松主要是由破骨細胞(osteoclasts，OC)產(chǎn)生的骨吸收大于成骨細胞(osteoblasts，OB)產(chǎn)生的骨再建所引起的。研究

2、發(fā)現(xiàn)，當機體受到骨吸收刺激時，成骨細胞／基質(zhì)細胞膜上表達的細胞核因子．KB受體活化因子配基(receptoractivatorofnuclearfactor-r,Bligand，RANKL)，通過與破骨細胞前體細胞膜上細胞核因子．1(B受體活化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-r．B，凡蝌K)結(jié)合，促進OC的分化和成熟。核因子．rd3(NF．r．B)信號通路是參與調(diào)控OPG抑制OC分化成熟的信號轉(zhuǎn)導通路之一，吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)作為NF．r,B特異性抑制劑被廣泛應用。本研究采用OPG瓜ANK依ANKL調(diào)控途徑在體外誘導破骨

3、細胞前體細胞凡州264．7細胞株生成OC，在此基礎上研究OPG抑制動物OC分化成熟的NF-rd3信號轉(zhuǎn)導機制，為從分子水平揭示動物骨營養(yǎng)不良性疾病的發(fā)生及防治提供理論依據(jù)。1．RAW264．7細胞培養(yǎng)及RANKL、OPG、PDTC對細胞增殖的影響RAW264．7細胞在DMEM培養(yǎng)基中，于5％C02，37。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。MTT法檢測其生長曲線，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，細胞增殖速度逐漸增加，第3d進入對數(shù)增長期，第5d進入穩(wěn)定期。通過MTT法，檢測不同濃度RANKL(0、10、30、50、70ng／mL)、OPG(0、10、20、40、50ng／mL)和PDTC(0、10、50

4、、100、150pM)對該細胞增殖的影響。結(jié)果表明：不同濃度RANKL均抑制細胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強，選取30ng／mL為實驗濃度；OPG在0--．50ng／mL濃度范圍內(nèi)，對細胞增殖無明顯作用，選取0、20、50ng／mL為實驗濃度；不同濃度的PDTC均抑制細胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強，選取100taM為作用濃度。2．RANKL體外誘導RAW264．7細胞株分化為OC及OPG的影響RAW264．7細胞以5×103ceUs／mL密度接種于96孔板，加入cL．MEM培養(yǎng)基，于5％C02，37"C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，至第6d。5％多聚甲醛固定，以抗酒石酸酸

5、性磷酸酶(TRAP)試劑盒染色，其中含有三個或三個以上細胞核的TRAP陽性多核細胞即為OC。在此基礎上，分組：A組為空白組，B組添加20ng／mLOPG，C組添加30ng／mLRANKL，D組添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG，E組添加30ng／mLRANKL+50ng／mLOPG。揚州大學碩士學位論文Il一誘導至第6d，5％多聚甲醛固定，TRAP試劑盒染色，生成的OC計數(shù)，結(jié)果表明：A、B組只有極少量的OC生成；C組生成TRAP陽性多核細胞數(shù)量極顯著高于其他組(尸<0．01)：D組生成TRAP陽性多核細胞數(shù)量極顯著低于C組(P

6、、B、E組(戶<0．01)；E組生成TRAP陽性多核細胞數(shù)量極顯著低于C、D組(P<0．01)。由此可見，C、D、E組在添加相同RANKL的基礎上，隨著添加OPG濃度的增加，OC數(shù)量逐漸減少，至50ng／mLOPG時，只有極少量的OC生成。3．OPG對OC形成過程中NF．KB信號轉(zhuǎn)導通路關鍵信號分子表達的影響在誘導RAW264．7細胞分化生成OC的過程中進行如下處理，A組為對照組，B組添加20ng／mLOPG，C組添加30ng／mLRANKL，D組添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG，E組添加30ng／mLRANKL+50ng／mLOPG。提取細胞核蛋白、

7、漿蛋白和細胞全蛋白，通過蛋白印跡(WesternBolt)技術檢測NF．r,Bp65及IrB的表達。結(jié)果表明，實驗組NF．r,Bp65表達量隨添加OPG濃度的增加而降低，細胞Ird3et、IIcBB表達量逐漸增加。添加100gMPDTC阻斷NF．rB信號轉(zhuǎn)導通路后，檢測上述關鍵信號分子的表達。在誘導RAW264．7細胞分化生成OC的過程中進行如下處理，A組添加100gMPDTC，B組添加20ng／mLOPG+100gMPDTC，C組添加30ng／mLRANKL+100gMPDTC，D組添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG+1