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《AMPK通路介導(dǎo)自噬調(diào)控高糖環(huán)境下破骨細(xì)胞形成與功能機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)：R681單位代碼：10159密級(jí)：公開學(xué)號(hào)：201520261碩士學(xué)位論文中文題目：AMPK通路介導(dǎo)自噬調(diào)控高糖環(huán)境下破骨細(xì)胞形成與功能機(jī)制研究英文題目：AMPKpathway-mediatedautophagyregulatesosteoclastformationandfunctioninhighglucoseconditions論文作者：蔡振煜指導(dǎo)教師：楊茂偉教授學(xué)科專業(yè)：外科學(xué)完成時(shí)間：2018年2月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文AMPK通路介導(dǎo)自噬調(diào)控高糖環(huán)境下破骨細(xì)胞形成與功能機(jī)制研
2、究AMPKpathway-mediatedautophagyregulatesosteoclastformationandfunctioninhighglucoseconditions論文作者蔡振煜指導(dǎo)教師楊茂偉教授申請(qǐng)學(xué)位醫(yī)學(xué)碩士培養(yǎng)單位第一臨床學(xué)院一級(jí)學(xué)科臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科外科學(xué)研究方向骨質(zhì)酥松論文起止時(shí)間2017年12月—2018年2月論文完成時(shí)間2018年2月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)（遼寧）2018年2月I中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要目的：物質(zhì)生活的豐富與人類壽命的延長(zhǎng)，使得慢性疾病對(duì)健康的威脅愈發(fā)占據(jù)
3、突出地位。其中，糖尿病是一種典型代表性疾病。糖尿病性骨質(zhì)疏松是糖尿病的重要并發(fā)癥之一,骨質(zhì)疏松病的特點(diǎn)為骨吸收增多，同時(shí)骨形成減少，造成骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)增高。高糖血癥是1型和2型糖尿病的共同特點(diǎn)，其可能是增加骨折風(fēng)險(xiǎn)的因素。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為葡萄糖能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化并增強(qiáng)其功能，但是，一部分學(xué)者的研究表明高糖會(huì)對(duì)破骨細(xì)胞起到抑制作用。因此，在高糖對(duì)于破骨細(xì)胞的影響問題上仍然存在爭(zhēng)議。自噬是一種主要負(fù)責(zé)消除受損蛋白和細(xì)胞器的過程，現(xiàn)在被廣泛認(rèn)為是一種抗衰老程序。并且，自
4、噬也被認(rèn)為是一種維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。自噬在破骨細(xì)胞中也起著重要作用。自噬蛋白Beclin-1通過誘導(dǎo)ROS和NFATc1基因的表達(dá)來作用于RANKL相關(guān)破骨細(xì)胞分化，同時(shí)，敲除Atg5，Atg7和LC3的破骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞特異性蛋白CTSK的分泌和特異性皺褶結(jié)構(gòu)形成的減弱。AMPK通路是一條主要的代謝調(diào)控通路，其激活與否與葡萄糖的多寡相關(guān)。同時(shí)，該通路可以通過調(diào)控下游mTORC1與ULK1元件對(duì)細(xì)胞自噬發(fā)揮作用。因此，本課題主要通過研究高糖環(huán)境對(duì)破骨分化和功能的影響，以及自噬在高糖環(huán)境下破骨
5、細(xì)胞分化與功能變化中的作用，同時(shí)觀察相關(guān)信號(hào)通路的變化情況，探討高糖環(huán)境影響破骨細(xì)胞分化和功能方面的分子機(jī)制。研究方法：使用CCK8試劑檢測(cè)不同濃度（5.5,10.5,15.5,20.5,25.5,和30.5mM/L）的葡萄糖以及不同時(shí)間點(diǎn)（第1至第6天）對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響；使用WesternBlotting法檢測(cè)不同糖濃度對(duì)誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞組織蛋白酶K（CathepsinK，CTSK）表達(dá)水平；使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒檢測(cè)不同糖濃度對(duì)誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響；
6、使用羥基磷灰石基質(zhì)骨吸收孔板檢測(cè)不同糖濃度對(duì)誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞吸收能力的影響。使用WesternBlotting法檢測(cè)低糖、高糖以及相應(yīng)濃度添加AMPK通路抑制劑CompoundC下誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞AMPK通路相關(guān)蛋白p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1和ULK1表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)此條件下自噬相關(guān)蛋白LC3I/LC3II和P62表達(dá)情況；使用WesternBlotting法檢測(cè)低糖（5.5mM/L）和高糖（30.5mM/L）濃度下誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白
7、Beclin-1、LC3I/LC3II和P62的表達(dá)情況；使用透III中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文射電子顯微鏡觀察低糖和高糖濃度下誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞自噬體數(shù)量情況；使用免疫熒光染色觀察低糖和高糖濃度下誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞內(nèi)源性點(diǎn)簇狀LC3聚集情況；使用WesternBlotting法檢測(cè)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）和巴佛羅霉素A1（BafilomycinA1,BafA1）以及自噬激動(dòng)劑雷帕霉素（Rapamycin,Rapa)作用下誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞自噬
8、相關(guān)蛋白LC3I/LC3II和P62以及破骨功能蛋白CTSK表達(dá)情況；同時(shí)使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒檢測(cè)此條件下對(duì)誘導(dǎo)至第四天的破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響。結(jié)果：從5.5mM/L至30.5mM/L的6組不同糖濃度培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無顯著影響，但是發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增加，破骨細(xì)胞功能蛋白CTSK表達(dá)逐漸下降，破骨細(xì)胞形成個(gè)數(shù)與骨吸收面積逐漸減少；低糖（5.5mM/L）和高糖（30.5mM/L）誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成4天后，與低糖環(huán)境相比，高糖條件下破骨細(xì)胞AMPK/mT
