希金斯刺盤孢t-dna插入體庫的篩選及相關(guān)突變體基因的克隆

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1、華中農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文希金斯刺盤孢T--DNA插入體庫的篩選及相關(guān)突變體基因的克隆姓名:趙典申請學位級別:碩士專業(yè):植物病理學指導教師:黃俊斌201206希金斯刺盤孢T-DNA插入體庫的篩選及相關(guān)突變體基因的克隆摘要由希金斯刺盤孢(ColletotrichumhigginsianumSacc.)侵染引起的十字花科蔬菜炭疽病是一類重要的世界性植物真菌病害,該菌分類地位屬于真菌門,半知菌亞門,炭疽菌屬。本實驗室以希金斯刺盤孢Ch一1菌株為出發(fā)菌株,已經(jīng)成功建立農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化體系并獲得4500多個T-DNA隨機插入突變體。通過培養(yǎng)性狀和將突變體分生孢子液分別接種活體和離體擬南芥葉片,并以野生型為

2、對照,比較其致病力差異;同時在塑料玻片上觀察突變體分生孢子是否正常形成附著孢的篩選方法,篩選了638株突變體,得到1株致病力喪失轉(zhuǎn)化子(Pch-1830),2株致病力減弱轉(zhuǎn)化子(Pch-lE240和Pch-1E590),1株生長緩慢轉(zhuǎn)化子(Pch-1E409),1株產(chǎn)泡狀菌絲轉(zhuǎn)化子(Pch.1E808),1株產(chǎn)類似厚垣孢子轉(zhuǎn)化子(Peh.1E43)和52株茵落白化轉(zhuǎn)化子(Pch.1E101等)。Pch.1830菌株不能使健康或針刺造成傷口的擬南芥離體或活體葉片發(fā)病,接種擬南芥葉片4d,只能觀察到正常的附著胞及極少數(shù)出生菌絲,沒有次生菌絲的形成。Southern雜交證實在Pch.1830T-D

3、NA標記為雙拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對突變體Pch.1830中T-DNA標記插入位點的側(cè)翼基因組序列進行克隆,經(jīng)過序列分析,其中一個T-DNA插入破壞的基因包含一個4612bp的完整開放閱讀框,包含三個內(nèi)含子、四個外顯子,編碼991個氨基酸蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進行同源性對比(blas中),發(fā)現(xiàn)該序列與綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)的DUF221(Domainofunknownfunction)具有高度同源相似性,相似度為98%,此蛋白功能未知。另一個T-DNA插入破壞的基因包含一個694bp的完整開放閱讀框,包含一個內(nèi)含子、兩個外顯予,編碼208個氨基酸蛋白

4、。將推定的蛋白氨基酸序列進行同源性對比(blastp),發(fā)現(xiàn)該序列與禾生炭疽菌(Glomerellagraminicola)的外切體構(gòu)件EXOSCl/CSL4(exosomecomponent)具有高度同源相似性,相似度為86%,此蛋白是一種復雜的外切體亞基,其功能是正確處理去除錯誤RNA和基因正常水平的維護。基因表達試驗表明DUF221基因在突變體Pch.1830菌絲培養(yǎng)過程中不表達。Pch.1E240菌株株不能使健康擬南芥離體或活體葉片發(fā)病,但能使車-I。刺的擬南芥葉片發(fā)病。顯微觀察發(fā)現(xiàn)該菌株接種健康擬南芥葉片4d,能正常形成附著胞、初生菌絲,但沒有形成次生菌絲。Southern雜交證實

5、在Pch一1E240T-DNA標記為單拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對突變體Pch.1E240中T-DNA標記插入位點的側(cè)翼基因組序列進行克隆,經(jīng)過序列分析,表明T-DNA插入破壞的基因其中一份包含一個2646bp華中農(nóng)業(yè)大學2012屆碩士學位論文的完整開放閱讀框,包含五個內(nèi)含子、六個外顯予,編碼669個氨基酸蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進行同源性對比(bla唧),發(fā)現(xiàn)該序列與禾生炭疽菌(Glomerellagraminicola)的乙酸輔酶A連接酶(Acetate.CoaLigase)具有高度同源相似性,相似度為98%,乙酰輔酶A是能源物質(zhì)代謝的重要中間代謝產(chǎn)物,是一個樞紐性的物質(zhì)。Pch-

6、lE590菌株接種健康的擬南芥葉片4d仍無發(fā)病癥狀,但能使刺傷或幼嫩的葉片正常發(fā)病,顯微觀察,能正常產(chǎn)生附著胞、初生菌絲、次生菌絲。Southern雜交驗證該菌株T-DNA插入拷貝數(shù)為雙拷貝。采用反向PCR技術(shù)對突變體Pch.1E590中T-DNA標記插入位點的側(cè)翼基因組序列進行克隆,僅獲得了一端基因序列,經(jīng)過序列分析,表明該T-DNA未插入到含有完整開放閱讀框的基因中。在篩選過程中還獲得了1株生長緩慢轉(zhuǎn)化子Pch-lE409。Southern雜交證實在T-DNA標記為單拷貝插入。采用反向PCR技術(shù)對Pch-IBE409中T-DNA標記插入位點的側(cè)翼基因組序列進行克隆,經(jīng)過序列分析,表明T-

7、DNA插入破壞的基因其中一份包含一個1947bp的完整開放閱讀框,包含三個內(nèi)含子、四個外顯子,編碼576個氨基酸蛋白。將推定的蛋白氨基酸序列進行同源性對比(blastp),發(fā)現(xiàn)該序列與禾生炭疽菌(Glomerellagraminicola)的胞裂蛋(dSeptin基因家族具有高度同源相似性,相似度為100%,此蛋白參與了細胞分裂、細胞極化、泡囊運輸及胞膜重構(gòu)等多個過程。關(guān)鍵詞:希金斯刺盤孢;擬南芥;突變體篩選

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