western blot 原理和操作方法

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1、WesternBlot原理和操作方法陳宇??發(fā)表于2009年08月03日16:14閱讀(4)評論(1)分類：個人日記舉報蛋白質(zhì)的樣品制備：?　　蛋白質(zhì)的樣品制備是Western?Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：?　　1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。?　　2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。?　　3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。?　　4：防

2、止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）?　　5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80℃中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。?　　一：準(zhǔn)備工作：?　　一個水浴箱，一臺超聲裝置，組織勻漿器?　　二：需要的溶液：?　　裂解液?Laemmli樣品緩沖液?　　三：操作步驟：?　　1)培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)樣品的制備：?　　1：胰酶酶解后裂解：?　　細胞培養(yǎng)至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細胞經(jīng)預(yù)冷

3、的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反復(fù)吹打。?　　2：皿上直接裂解：?細胞培養(yǎng)至80%左右密度時，細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。?　　以上所得的樣品最終用超聲細胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進行，后4℃25000g離心1小時取上清或以最大強度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli?樣

4、品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強力混勻，樣品置100℃水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持數(shù)月）?　　2)組織樣品的制備：?　　手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進行勻漿，離心收集上清（如

5、有粘稠物可超聲處理，具體方法見細胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持數(shù)月。）?附：?一：裂解液

6、的制備：?組織裂解液（全細胞蛋提取）：1：Tris-HCL?50mmoL/L?PH?7.4?2:?Nacl?150?mmoL/L?3:?去氧膽酸鈉?0.25%?4：NP-40或Triton-x-100?1%?5:?EDTA?1?mmoL/L?6：?PMSF?1?mmoL/L?7：?Aprotinin?1μg/ml?8:?leupeptin?1μg/ml?9:?pepstain?1μg/ml?其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。細胞裂解液：1：NP-40裂解體系：　150?mmoL/L?Nacl?

7、1.0%NP-40或Triton-x-100??50?mmoL/L?Tris(PH8.0)?2：RIPA裂解體系：150?mmoL/L?Nacl?1.0%NP-40或Triton-x-100?0.5%脫氧膽酸鈉?0.1%SDS?50?mmoL/L?Tris(?ph8.0)?二：Laemmli?樣品緩沖液配置（1*SDS樣品緩沖液）?50?mmoL/L?Tris-HCL?（PH8.0）?100?mmoL/L?DTT?2%?SDS?0.1%?溴酚藍?10%?甘油?此液可以配置成不同的儲存液，根據(jù)蛋白濃度而

8、定，40C長期保存，用時臨時與蛋白液按比例混合，其中DTT應(yīng)臨時加入，以防降解。??蛋白質(zhì)定量?1)Bradford法:?檢測原理:?Bradford與蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍色,595nm檢測.該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.?①Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍G