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1、南方醫(yī)科大學(xué)2010級(jí)博士學(xué)位論文伴放線放線桿菌磷脂酰膽堿致病機(jī)制的初步研究PreliminaryResearchonPhosphorylcholineinPathogenesisofAggregatibacteractinomycetemcomitans課題來源：白選課題學(xué)位申請(qǐng)人王勤導(dǎo)師姓名曹虹教授章錦才教授專業(yè)名稱病原生物學(xué)培養(yǎng)類型學(xué)術(shù)型培養(yǎng)層次博士研究生所在學(xué)院公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院2013年4月03日廣州博士學(xué)位論文伴放線放線桿菌磷脂酰膽堿致病機(jī)制的初步研究博士研究生：王勤f
2、IIjIIIIIIIIIIIIlUlMI
3、IIIiiiiiiiiiiiilUllIIIIIIIIIIII『指導(dǎo)教師：曹虹教授章錦才教授舅61璺771摘要研究背景伴放線放線桿菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，Aa)是近年來牙周炎細(xì)菌病因?qū)W研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，是一種公認(rèn)的牙周致病菌，特別是與侵襲性牙周炎關(guān)系密切。Aa以生物膜形式寄居在人類口腔中，在生長(zhǎng)期間排出許多膜泡，內(nèi)含內(nèi)毒素、白細(xì)胞毒素和骨吸收因子等毒性因子。其產(chǎn)生的內(nèi)毒素及以自細(xì)胞毒素(1eukotoxin，LT)為代表的細(xì)胞致死膨脹毒素(cytolethaldistend
4、ingtoxin，CDT)等可溶性介質(zhì)能夠降低宿主抵抗力，導(dǎo)致牙周組織的迅速破壞，在牙周炎的發(fā)生與發(fā)展過程中起重要作用。磷脂酰膽堿(phosphorylcholine，PC)是動(dòng)植物細(xì)胞的必需組分，富含于神經(jīng)組織，特別是髓鞘和蛋黃中。研究發(fā)現(xiàn)PC存在于多種病原菌中，包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。目前的研究表明PC可能是病原菌的重要致病因予。目前，磷脂酰膽堿在大部分病原菌的致病機(jī)制中的作用尚不清楚。通過對(duì)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞壁的膽堿成分通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的血小板活化因子受體(Plateletactiv
5、atingfactor-receptor，PAFR)結(jié)合來介導(dǎo)侵襲。PAFR分布于多種內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面，PAFR的天然配體血小板活化因子(Plateletactivatingfactor，PAF)含有磷脂酰膽堿，細(xì)菌細(xì)胞壁中的磷摘要脂酰膽堿可通過模擬血小板活化因子，與血小板活化因子受體結(jié)合而幫助細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞。以往的研究發(fā)現(xiàn)在口腔齦上和齦下菌斑中大多數(shù)的細(xì)菌可以表達(dá)PC，如口腔鏈球菌、具梭核桿菌、伴放線放線桿菌、各種放線菌屬及奈瑟菌屬等。Schenkein等人發(fā)現(xiàn)攜帶PC的A丑菌株與不攜帶PC的Aa菌株致病力有明顯差異
6、。提示PC可能是Aa導(dǎo)致牙周病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的致病因子。然而，目前對(duì)于Aa細(xì)菌株上含有的磷脂酰膽堿通過哪些信號(hào)通路來介導(dǎo)了Aa對(duì)宿主細(xì)胞的黏附侵襲尚未見有人報(bào)道。本課題擬通過分離臨床Aa菌株，篩選出PC陽(yáng)性的Aa菌株，探討PC介導(dǎo)Aa黏附侵襲宿主細(xì)胞的可能機(jī)制，為研究Aa的致病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。一、PC陽(yáng)性的Aa菌株的分離及鑒定采集侵襲性牙周炎患者的牙周袋內(nèi)的非附著性菌斑，接種于選擇性培養(yǎng)基TSBV平板上，觀察菌落的形態(tài)挑選可疑菌落，根據(jù)觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性、革蘭染色實(shí)驗(yàn)陰性及16SrDNA鑒定，篩選出伴放線放線桿菌臨床分離
7、株7株。將所得的臨床菌株全細(xì)胞進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS—PAGE)電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察細(xì)菌蛋白的表達(dá)。并采用蛋白免疫印跡法(WesternBlot)檢測(cè)細(xì)菌表面蛋白對(duì)磷脂酰膽堿單克隆抗體TEPC一15的反應(yīng)情況，最終篩選出磷脂酰膽堿陽(yáng)性表達(dá)的Aa菌株1株。二、PAFR在PC陽(yáng)性Aa菌株致病過程中的作用研究1．PC對(duì)細(xì)菌黏附和侵襲的影響為了研究PC的表達(dá)在Aa黏附和侵襲人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，r_fUVEC)過程中的作用，我們采用抗PC的特異性單克隆抗體
8、TEPC一15抗體預(yù)處理HUVEC30min后，分別與PC陽(yáng)性和陰性的Aa臨床分離株在37。C共孵育4h后，觀察細(xì)菌的對(duì)HUVEC的黏附和侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC陽(yáng)性的AaI臨床分離株的黏附力和侵襲力均發(fā)生了顯著卜．降(尸<0．05)，分別為對(duì)照組的31．87+4．22％和24．63+3．55％。而用TEPC．15抗體預(yù)博士學(xué)位論文處理細(xì)胞以后，PC陰性的Aa對(duì)HUVEC的黏附力和侵襲力則無顯著差異(胗0．05)。2．PAFR對(duì)細(xì)菌黏附侵襲的影響為了研究PAFR是否參與了Aa對(duì)HUVEC的黏附和侵襲過程，我們利用PAFR拮抗劑(
9、CV3988)和抗PAFR抗體作用于HUVEC30min后，進(jìn)行了細(xì)菌的黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)lOOnm，200nm和500rim的PAFR拮抗劑預(yù)處理HUVEC，顯著減少了PC陽(yáng)性Aa對(duì)HUVEC的黏附和侵襲滬<0．001)，黏附率分別為對(duì)照組的36．29士3．52％，1
