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1、蘭州交通大學化學與生物工程學院綜合能力訓練Ⅰ——文獻綜述題目：基因敲除技術研究進展作者：王振宇學號：201207744指導教師：謝放完成日期：2014-7-16基因敲除技術研究進展摘要基因敲除是自20世紀80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。在總結已有研究成果的基礎上，本文對基因敲除技術的概況、原理方法應用以及近年來基因敲除技術的研究進展作一個簡單的綜述。關鍵詞基因敲除RNAi生物模型基因置換基因打靶同源重組1.基因敲除技術簡介?基因敲除(Geneknockout)是指一種
2、遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。基因敲除借助分子生物學、細胞生物學和動物胚胎學的方法,通過胚胎干細胞這一特殊的中間環(huán)節(jié)將小鼠的正常功能基因的編碼區(qū)破壞,使特定基因失活,以研究該基因的功能；或者通過外源基因來替換宿主基因組中相應部分,以便測定它們是否具有相同的功能，或將正?；蛞胨拗骰蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治
3、療的目的?；蚯贸墙沂净蚬δ茏钪苯拥氖侄沃?。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),從而達到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術的發(fā)展,除了基因打靶技術外,近年來新的原理和技術也逐漸被應用,比較成功的有RNA干擾技術,同樣也可以達到基因敲除的目的。簡單的說基因敲除是指將目標基因從基因組中刪除?；蚯贸夹g主要應用于動物模型的建立，而最成熟的實驗動物是小鼠，對于大型哺乳動物的基因敲除模型還處于探索階段。這項技術的誕生可以說是分子生物學技術上繼轉基因技術后的又一革命。尤其是條件性
4、、誘導性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發(fā)展將為發(fā)育生物學、分子遺傳學、免疫學及醫(yī)學等學科提供了一個全新的、強有力的研究、治療手段，具有廣泛的應用前景和商業(yè)價值。舉一個簡單的例子[1]：比如有一段"序列":"1234567890"(原基因),敲除后為：“1237890”,一般一個敲除載體還會在其中插入一段外源基因,如“ABC”,則新的基因為:“123ABC7890”；或者不插入基因直接連接，則為“1237890”?；蚯贸募毎A——胚胎干細胞：胚胎干細胞（Embryoonic
5、stemcells，ESC）是早期胚胎細胞經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)建立的多能性細胞系，體外培養(yǎng)時保持了未分化狀態(tài)，可以傳代增值，在發(fā)育上類似于動物早起胚胎的內細胞團細胞，具有與早期胚胎細胞相似的分化潛能和正常整倍體核型兩大特點，是研究哺乳動物個體發(fā)育、胚胎分化以及性狀遺傳機制的理想模型。ESC是進行基因敲除研究不可替代的材料。目前，雖然體外培養(yǎng)乳腺細胞、胎兒成纖維細胞等細胞類型的技術都已相當成熟，對這些類型的細胞進行基因組修飾也是完全可能的，但ESC的另一特性是其他任何類型的細胞都不具備的，那就是當將一定數(shù)目的ESC注入囊胚期小鼠的囊胚腔
6、后這些細胞就可以參與包括生殖腺在內的各種組織嵌合體的形成，在此基礎上，通過檢測和選配，篩選出基因組中正常基因被破壞的動物個體，通過行為觀察、生理生化指標檢測等手段可以揭示該基因的作用。迄今為止，只有小鼠干細胞的建系方法最成熟、效果最穩(wěn)定，因此小鼠是基因敲除研究的唯一的實驗動物模型。2.實現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法：2.1利用基因同源重組進行基因敲除?基因敲除是應用DNA同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術基礎[2]。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了
7、基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型[6]。直到現(xiàn)在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。?2.1.1條件性基因敲除法?條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎上，利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。利用Cre／LoxP?
8、和來自酵母的FLP—frt?系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導致的表型。通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的1oxP，并以此兩側裝接上loxP?的ES?細胞產(chǎn)生“l(fā)oxPfloxed”小鼠,然后，通過將
