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《六個小麥抗葉銹病近等基因系mrna表達(dá)差異研究》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、六個小麥抗葉銹病近等基岡系mRNA表達(dá)差異研究(mRNAdifferentialdisplayreverse咖s謝州onPCRDDRT-PCR)p41、eDNA代表性差異分析(eDNArepresentationaldifferenceanalysis,eDNA.RDA)【巧J、若減雜交(subtrantivehybridization,SH)、抑制消減雜交(suppressionsubtractivehybridization。SSH)口州和eDNA-AFLP(complementaryDNAamplifiedfragmentslengthpolymorphism)p¨
2、。eDNA-AFLP作為新的mRNA指紋圖譜技術(shù),可用于研究樣本間mRNA水平基因的表達(dá)差異,可以篩選大量不同表達(dá)的eDNA片段,進(jìn)而分離大量特異表達(dá)的基因。因此,利用eDNA-AFLP進(jìn)行基岡差異表達(dá)、表達(dá)基因遺傳連鎖作圖和基因克隆等方面研究具有廣闊的應(yīng)用前景。1.3eDNA.AFLP的基本原理及其研究進(jìn)展eDNA-AFLP技術(shù)是Bachem等177J以AFLP為基礎(chǔ)發(fā)明的用于mRNA差異表達(dá)分析方法,它結(jié)合了RT-PCR和AFLP技術(shù)。其基本原理是:從總RNA中純化出mRNA作為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成eDNA第l鏈,在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下,用置換法合成
3、eDNA第2鏈。得到雙鏈eDNA后用識別序列分別為6個堿基和4個堿基的2種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。其中識別6個堿基的為稀有切點(diǎn)酶(rarecutter),識別4個堿基的為常見切點(diǎn)酶(frequentcutter),要達(dá)到的理想效果,前者對于系統(tǒng)中每一種eDNA應(yīng)該只切1次,而后者在前者切點(diǎn)的臨近位置進(jìn)行切割,使產(chǎn)生100bp至1000bp長度的片段,以便被測序膠可以有效地分辨。酶切后添加雙鏈錨定接頭,使酶切后的片段與接頭相連接,產(chǎn)生初級擴(kuò)增模板,再加入與接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,產(chǎn)生次級擴(kuò)增模板。預(yù)擴(kuò)增過程可為后來進(jìn)一步的選擇性擴(kuò)增提供了大量的次級擴(kuò)增模板,這也是
4、cDNA-AFLP只需要很少量的起始材料(大約為100"---200rag)即可進(jìn)行擴(kuò)增的原因。在選擇性擴(kuò)增階段,使用比預(yù)擴(kuò)增引物添加l至多個堿基的引物有選擇的擴(kuò)增限制性片段,擴(kuò)增的產(chǎn)物TDF通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,從電泳圖譜中找出差異表達(dá)的片段。cDNA-AFLP技術(shù)保留了AFLP多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高、無需了解序列信息等優(yōu)點(diǎn)的同時,集中顯示基因組表達(dá)序列的多態(tài)性差異;重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠、效率高【78q”可對生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析;并且獲得的轉(zhuǎn)錄衍生片段(transeript-derivedfragments,TDr)一般也集中在蛋白的編碼區(qū)或者附近,可最人
5、限度的提供基因編碼區(qū)的信息。cDNA艦P所需的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備也比較簡單,已經(jīng)成為目前篩選差異表達(dá)基因最有效的方法。目前,該技術(shù)已成功地應(yīng)剛丁植物胚胎發(fā)育剛、形態(tài)發(fā)生【83】、果實(shí)發(fā)育‘叫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)【8卯、植物抗熱刪、抗鹽【871、抗冷【88】、抗旱【s9l、抗病性【螂,以及植物與真菌互作有關(guān)的基因的比較鑒定與克隆19ll。目前,該技術(shù)已廣泛慮用于馬鈴薯【92,931、玉米【941、小麥[95.96]、水稻[97,98】、棉花【991、菊苣‘1刪、大豆【101】、黃豆fl021、豌豆【i031、甜菜n041、煙草【1051、藜屬植物11蚓等作物的差異表達(dá)研究,克隆和分離出多個
6、有價值的基岡,并且該技術(shù)在鑒定野生菌種的致病性中也有應(yīng)用11071。QiIl等開發(fā)的計(jì)算機(jī)程序GenEST使得eDNA.AFLP與已知的EST(expressedsequencetag)序列有效的結(jié)合起來,已經(jīng)成為分離差異表達(dá)基因并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行深入的基因功能分析的新工具。eDNA.AFLP作為一種分子生物學(xué)技術(shù)方法,已經(jīng)成為研究差異表達(dá)基因的重要工具,并逐漸顯示出它在基因功能的全面分析上的巨大應(yīng)用價值。有理由相信,eDNA.AFLP必將在后基因組時代發(fā)揮更大的作用,成為促進(jìn)生命科學(xué)發(fā)展的新動力。3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位(畢業(yè))論文1.4研究意義小麥抗葉銹病基因Lr9、Lr
7、l5、Lrl9、Lr25、Lr38和Lr45分別來源于小傘山羊草、普通小麥Kenya、長穗偃麥草、黑麥、中間偃麥草和日本小黑麥的雜交后代,分別位于6BL、2D、7DL、4AB、2AL和2AS染色體上,對我國的小麥葉銹菌具有很強(qiáng)的抗葉銹性。小麥抗葉銹病基因Lr9,Lrl5,Lrl9,Lr25,£r38,Lr45均是在小麥苗期即開始表達(dá)的抗葉銹基因,抗感表現(xiàn)型比較明顯,從而便于分離小麥抗葉銹病近等基因系之間的基因表達(dá)差異。為明確上述六個基因與小麥葉銹菌互作的分子特性,本試驗(yàn)以小麥抗葉銹病近等基因系TcLr9、TcLrl5、TcLr