布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測方法與血清快速診斷試紙的初步分析

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1、布魯氏菌熒光定量PCR檢測及血清學(xué)快速試紙的初步研制引言布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患慢性傳染病。布魯氏菌是革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌,能感染許多種動(dòng)物和人。目前,根據(jù)致病性及宿主的不同將布魯氏菌分成6個(gè)種,即馬耳他布魯氏菌(Brucellamelitensis)、流產(chǎn)布魯氏菌(Br.abortus)、豬布魯氏菌(Br.suis)、沙林鼠布魯氏菌(Br.enotomae)、綿羊布魯氏菌(Br.ovis)、犬布魯氏菌(Br.canis)。其中在家畜中牛、羊、豬最常

2、發(fā)生,且可以由牛、羊、豬傳染與人和其他家畜。本病對(duì)公眾健康的威脅及對(duì)畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,引起世界各國的廣泛關(guān)注,由此各國學(xué)者非常重視對(duì)布魯氏菌診斷方法的研究。診斷布魯氏菌病的方法通常包括病原學(xué)檢測和血清學(xué)檢測。然而細(xì)菌學(xué)檢測雖然是診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn),可是費(fèi)時(shí)、操作條件嚴(yán)格并且具有一定的危險(xiǎn)性。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測如琥紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(SAT)、2-巰基乙醇凝集試驗(yàn)(2-MET)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)等,容易在檢測時(shí)與其它細(xì)菌間發(fā)生交叉反應(yīng),并且檢測時(shí)操作和專業(yè)要求較嚴(yán)格??紤]到

3、上述問題,本實(shí)驗(yàn)也分別從布魯氏菌的病原學(xué)和血清學(xué)檢測方面進(jìn)行研究。我們根據(jù)已報(bào)道布魯氏菌特異的基因序列設(shè)計(jì)引物并合成,通過優(yōu)化反應(yīng)體系和條件,成功建立了布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法,該方法有較高的敏感性和特異性,為布魯氏菌病的早期診斷、定量分析奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了檢測布魯氏菌血清學(xué)的膠體金免疫層析試紙條的初步研究。我們利用純化的BP26蛋白做為檢測線,以膠體金標(biāo)記SPA為指控線制作膠體金試紙條,經(jīng)研究證明該試紙條特異性、敏感性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好。免疫層析技術(shù)是上世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來的以膠體金為標(biāo)

4、記物的簡便、快速的檢測方法,是一種把免疫親和技術(shù)、印漬術(shù)和斑點(diǎn)的薄層層析技術(shù)組合在一起的新技術(shù)。由于用該層析條檢測的時(shí)候,所有樣品均經(jīng)過較窄的纖維素膜的持續(xù)性反應(yīng),實(shí)際上對(duì)被測的物質(zhì)起到濃縮、聚集作用,提高了反應(yīng)的靈敏度,加快了反應(yīng)速度,整個(gè)操作時(shí)間僅需3~15分鐘。因此本試紙條檢測在基層的推廣使用上有廣闊的前景。VII布魯氏菌熒光定量PCR檢測及血清學(xué)快速試紙的初步研制第一章文獻(xiàn)綜述布魯氏菌外膜蛋白及檢測技術(shù)研究進(jìn)展布魯氏菌(Brucella)也稱布氏桿菌,是一種球狀、球桿狀或卵圓形的革蘭氏陰性[1-3]菌,

5、根據(jù)病原性、宿主特性和表型特征的不同,1985年WTO布魯氏菌病專家委員會(huì)將布魯氏菌屬分為6個(gè)種即馬爾他布魯氏菌(B.melitensis)、流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus)、綿羊布魯氏菌(B.ovis)、豬布魯氏菌(B.suis)、犬布魯氏菌(B.canis)和沙林鼠布魯氏菌[4-5](B.neotomae)6個(gè)種。6種又有19個(gè)生物型:羊種菌(3個(gè)型)、牛種菌(8個(gè)型)、[6-7]豬種菌(5個(gè)型)、犬種菌、綿羊附睪種菌及沙林鼠種菌各一個(gè)型。從1994年開始,人們陸續(xù)從海洋動(dòng)物包括海豚、小鯨魚、海豹、及水獺

6、中分離到了第七種生物型的布魯[8-10]氏菌,并且證明從海洋動(dòng)物中分離到的布魯氏菌的致病性和分子特征與上述已知6[11]種布魯氏菌不同,是一種新的生物型布魯氏菌。1布魯氏菌外膜蛋白布魯氏菌細(xì)胞膜是一個(gè)三層膜的結(jié)構(gòu),最內(nèi)層的膜稱為細(xì)胞質(zhì)膜、外層膜稱為外周胞質(zhì)膜,最外層膜稱為外膜。外膜與肽聚糖(peptidoglycan,PG)層緊密結(jié)合組成細(xì)胞壁,[12]外膜含有脂多糖(lipolpolysaccharide,LPS)、蛋白質(zhì)和磷脂層,外膜的蛋白質(zhì)也叫外膜蛋白(outermembraneproteins,OMPs

7、)。外膜蛋白在S型布魯氏菌表面由于受到LPS的遮蓋,不能充分暴露出來,R型布魯氏菌表面缺少O鏈,OMP能夠顯露出來,所以[13]被視為是布魯氏菌表面重要的保護(hù)性抗原。到目前為止,布魯氏菌表面的主要OMPs有7類已被發(fā)現(xiàn),根據(jù)分子量大小將它們[14-16]分為10、16.5、19、25~27、31~34、36~38和89kDa。其中25~27、31~34、36~38kDa是菌體表面最主要的外膜蛋白,25~27和36~38kDa主要存在于B.abortus細(xì)胞表面,31~34kDa在B.abortus細(xì)胞表面存在較

8、少,但卻是B.meltiensis和B.suis細(xì)胞表面主要的OMPS。其中36~38kDa稱為2組蛋白,是一種外膜的孔蛋白;25~27和31~34kDa稱為3組蛋白,2組蛋白和3組蛋白以共價(jià)鍵的形式與細(xì)胞外膜的膚聚糖層緊[17-19]密結(jié)合。布魯氏菌外膜蛋白的研究,對(duì)于布魯氏菌的種型鑒定、遺傳變異分析及布魯氏菌病的免疫預(yù)防均具有重要意義,所以下面將幾個(gè)主要的外膜蛋白做重點(diǎn)介紹。1.1

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