海水養(yǎng)殖魚(yú)類鰻弧菌分離株的血清型和基因型鑒定

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)CharacterziationofSerotypeandgenotypeofVibrioanguillarumstrainsisolatedfrommarinefishThesissubmittedtoQingdaoAgo'culturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeOf—MasterofAgronomy1一一ZhaoLuning(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：P

2、rof．ZhangLecuiProf．MoZhaolanQingdao．ChinaJune．2014萬(wàn)方數(shù)據(jù)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。如不實(shí)，本人負(fù)全部責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名：蔥t掉簽字日期．和腳6月撕學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)

3、家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))學(xué)位論文儲(chǔ)繇趟查牢導(dǎo)師簽字：簽字日期：銣l耳年6月之6日1緣如緝簽字日期：-刎{：年鄉(xiāng)月以日萬(wàn)方數(shù)據(jù)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩上學(xué)位論文摘要海水養(yǎng)殖魚(yú)類鰻弧菌分離株的血清型和基因型鑒定摘要鰻弧菌(Vibrioanguillarum)屬于革蘭氏陰性茵，是海水養(yǎng)殖魚(yú)類的主要病原菌，給水產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鰻弧菌有23種血

4、清型，其中01、02、03為主要的致病菌。本研究將本實(shí)驗(yàn)室近10年分離和收集自海水養(yǎng)殖魚(yú)類的鰻弧茵臨床菌株進(jìn)行生理生化和抗生素敏感性檢測(cè)、血清學(xué)分型、基因分型，旨在了解我國(guó)海水魚(yú)類養(yǎng)殖環(huán)境的鰻弧菌的血清型，分析血清型與基因型的關(guān)系，為進(jìn)行鰻弧茵分子流行病學(xué)研究及疾病控制打下基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下：1．生理生化和16SrRNA基因分析：共有36株菌用于研究(包括3l株臨床分離株和5株標(biāo)準(zhǔn)株)。用APIID32E鑒定系統(tǒng)分析菌株的生理生化特征，結(jié)果顯示，所有菌株顯示吲哚反應(yīng)陽(yáng)性，在賴氨酸脫羧酶、脲酶、L．阿拉伯糖醇、5．酮基葡萄

5、糖酸鈉、側(cè)金盞花醇、p．葡萄糖酸酶、N．乙酰．D葡萄糖苷酶、D．阿拉伯糖醇、肌醇的反應(yīng)顯示為陰性；多數(shù)菌株的精氨酸雙水解酶(86．1％)、J3-葡萄糖苷酶(86．1％)和D．半乳糖苷酶(97．2呦的反應(yīng)為陽(yáng)性。鰻弧茵菌株既有穩(wěn)定的生理生化性狀，也有生理生化性狀的多樣性，但利用APl32E未能將待檢菌株鑒定到種的地位。為此，將擴(kuò)增得到的16SrRNA基因序列在GenBank上進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示有3l株菌與鰻弧菌相似性為99．100％，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中聚為一類，具有最近親緣關(guān)系。根據(jù)這個(gè)結(jié)果將31株待測(cè)菌株鑒定為鰻孤菌。2．

6、抗生素敏感性分析：利用ATB檢測(cè)系統(tǒng)分析菌株的抗生素敏感性，結(jié)果顯示，90％以上菌株對(duì)24種抗生素敏感；有80．6％(29株)菌的對(duì)9~16種的抗生素產(chǎn)生耐藥，有25％(9株)的菌株對(duì)16種以上的抗生物產(chǎn)生耐藥。其中，所有菌株對(duì)林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林／克拉維酸、苯唑西林、青霉素等7種抗生素耐藥，94．4％(34株)的菌株對(duì)紅霉素、原始霉素、泰洛星等3種抗生素耐藥，86．1％(31株)菌株對(duì)磺胺甲惡唑耐藥。3．血清學(xué)分型：制備了鰻弧菌01．05血清型兔抗血清，采用玻片凝集試驗(yàn)，對(duì)31株鰻弧菌臨床菌株進(jìn)行

7、血清型分型。結(jié)果如表顯示，各血清型數(shù)量分別為：01血清型16株，02為5株，03為3株，05為1株，有6株菌株不屬于01．05血清型。這個(gè)結(jié)果表明，我國(guó)海水養(yǎng)殖環(huán)境存在01—03血清型的鰻弧菌致病菌萬(wàn)方數(shù)據(jù)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩-上學(xué)位論文摘要株，其中01為主要血清型。4．多位點(diǎn)序列分型(MLST)：PCR擴(kuò)增5個(gè)持家基因序列，包括aroA(編碼5一烯醇丙酮莽草酸．3．磷酸合酶)、愆叫(編碼RecA蛋白)、pyrC(編碼二氫乳清酸酶)、腳砌(編碼蘋(píng)果酸脫氫酶)、toxR(編碼ToxR蛋白)，進(jìn)行單基因和多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和分析，

8、用于鰻孤菌基因型分析。結(jié)果顯示，基于單個(gè)基因(除pyrC基因外)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以將01和03血清型鰻弧茵區(qū)分；基于5個(gè)基因位點(diǎn)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可將鰻弧菌5種血清型區(qū)分。表明本研究建立的MLST可用于鰻弧茵的基因分型。關(guān)鍵詞：鰻弧菌；血清學(xué)分型；基因分型；多位點(diǎn)序列分型(MLST)；生理生化