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《糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞中前列腺素合成關(guān)鍵酶-2基因表達(dá)的分子機(jī)制》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞中前列腺素合成關(guān)鍵酶-2基因表達(dá)的分子機(jī)制姓名：朱小鷗申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物物理學(xué)指導(dǎo)教師：孫剛200905復(fù)口．大學(xué)碩七學(xué)位論文糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞中前列腺素合成關(guān)鍵酶環(huán)氧合酶一2基因表達(dá)的分子機(jī)制中文摘要流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)兒成年后可能易患心血管疾病、糖尿病和肥胖等。因此，防治早產(chǎn)是優(yōu)生優(yōu)育的重要一環(huán)，但目前尚缺乏防治和預(yù)測早產(chǎn)的有效手段，其主要原因是人類分娩啟動(dòng)的機(jī)制尚未解析。因此，解析人類分娩啟動(dòng)機(jī)制、優(yōu)生優(yōu)育已經(jīng)成為國際生殖生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。糖皮質(zhì)激素是經(jīng)典的抗炎激素，可以誘導(dǎo)抗
2、炎因子的合成并抑制炎癥介質(zhì)如前列腺素(PG)的合成，但大量實(shí)驗(yàn)表明，糖皮質(zhì)激素對人羊膜前列腺素的合成具有反常的促進(jìn)作用，由于PG在分娩時(shí)可促進(jìn)子宮平滑肌收縮即能誘發(fā)宮縮、促進(jìn)宮頸成熟及促進(jìn)胎膜破裂，所以其在分娩發(fā)動(dòng)中起主導(dǎo)作用。因此糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜PG合成的作用可能是分娩發(fā)動(dòng)的重要機(jī)制之一?，F(xiàn)已明確，糖皮質(zhì)激素的反常促進(jìn)羊膜前列腺素合成的作用是通過誘導(dǎo)羊膜成纖維細(xì)胞胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)和-fiij'歹,J腺素H合酶一2(PGHS一2)即環(huán)氧合酶一2(CoX一2)表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，但其分子機(jī)制尚未闡明。本課題克隆了人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因的啟動(dòng)子，在此基
3、礎(chǔ)上研究了糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因表達(dá)的分子機(jī)制，以初步解析糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞PG合成的分子機(jī)制。研究內(nèi)容：首先通過實(shí)時(shí)定量PCR從COX-2mRNA水平驗(yàn)證糖皮質(zhì)激素(Gc)對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的反常促進(jìn)作用，同時(shí)研究糖皮質(zhì)激素對COX一2表達(dá)反常促進(jìn)作用的特點(diǎn)，即是否受糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)、其作用是否通過刺激轉(zhuǎn)錄過程實(shí)現(xiàn)的。其次，如果糖皮質(zhì)激素對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)確有反常促進(jìn)作用，而且此作用依賴于轉(zhuǎn)錄過程，我tfJ貝,J對人羊膜成纖維細(xì)胞COX一2基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及構(gòu)建報(bào)告基因重組質(zhì)粒并做進(jìn)一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染
4、實(shí)驗(yàn)，以確定糖皮質(zhì)激素是否對COX-2基因啟動(dòng)子具有直接作用以及糖皮質(zhì)激素對COX一2基因啟動(dòng)子反常促進(jìn)作用的特點(diǎn)；如果糖皮質(zhì)激素確實(shí)對COX一2基因啟動(dòng)子具有直接作用，那么我們需要進(jìn)一步確定COX一2基因啟動(dòng)子上介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素作用的順式作用元件。為了驗(yàn)證糖皮質(zhì)激素對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的反常促進(jìn)作用的特異性，我們同時(shí)也在人胎兒肺成纖維細(xì)胞株(HFL-1)中做了比較對照實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)糖皮質(zhì)激素反常促進(jìn)人羊膜成纖維細(xì)胞COX_2表達(dá)的可靠性。復(fù)．口．火學(xué)碩十學(xué)位論文主要研究方法：l、取樣、收集、培養(yǎng)人足月?lián)衿谄蕦m產(chǎn)羊膜成纖維細(xì)胞，抽提人羊膜成纖維細(xì)胞mRNA、逆轉(zhuǎn)錄
5、并做熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)對COX-2mRNA水平的影響，并與HFL一1細(xì)胞進(jìn)行比較。2、克隆人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2基因啟動(dòng)子，構(gòu)建COX-2基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞，研究在這兩種細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)對COX-2基因啟動(dòng)子活性影響的異同。3、構(gòu)建不同5’未端長度的COX-2啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人羊膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞及HFL-I細(xì)胞以找出糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇)對COX-2基因啟動(dòng)子的大致調(diào)節(jié)位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上對可能位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，以確認(rèn)介導(dǎo)皮質(zhì)醇作用的順式反應(yīng)元件。4．在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用染色
6、質(zhì)免疫沉淀(CHIP)的方法，研究所推斷的轉(zhuǎn)錄因子是否可以與所識(shí)別的介導(dǎo)皮質(zhì)醇作用的順式反應(yīng)元件相結(jié)合。主要研究結(jié)果：1．皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)確有反常促進(jìn)作用，而在人胎兒肺細(xì)胞株中糖皮質(zhì)激素對COX-2mRNA的表達(dá)則是經(jīng)典的抑制作用，而且皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞COX-2表達(dá)的反常促進(jìn)作用可以被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486和mRNA轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB所阻斷，說明此反常促進(jìn)是由GR受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)過程。2．從培養(yǎng)的人羊膜成纖維細(xì)胞中成功克隆了COX一2基因啟動(dòng)子一886bp一一--+33bp片段，經(jīng)測序，該序列與Genbank中所報(bào)道序列相同。
7、將克隆的CoX一2基因啟動(dòng)子與含報(bào)告基因的質(zhì)粒進(jìn)行重組和擴(kuò)增，并用其轉(zhuǎn)染人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇在人羊膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞中對COX-2基因啟動(dòng)子活性具有劑量依賴性促進(jìn)作用，而且可以被RU486所阻斷，而在HFL細(xì)胞中皮質(zhì)醇對COX-2啟動(dòng)子活性則是經(jīng)典的劑量依賴性抑制作用，而且也可以被RU486所阻斷，另外，皮質(zhì)醇還可以阻斷白細(xì)胞介素一lB對COX一2基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)作用。3．我們進(jìn)一步采用了由5’末端向3’末端逐漸刪除COX-2基因啟動(dòng)子的方法，研究了介導(dǎo)皮質(zhì)醇對人羊膜成纖維細(xì)胞和HFL一1細(xì)胞COX-2基
