靶向調(diào)節(jié)nlrp1炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡治療阿爾茨海默病

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1、萬方數(shù)據(jù)靶向調(diào)節(jié)NLRPl炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡治療阿爾茨海默病學(xué)位論文答辯日期：指導(dǎo)教師簽字：答辯委員會(huì)成員簽字：yl峰．1V．1，萬方數(shù)據(jù)謹(jǐn)以此論文獻(xiàn)給：我尊敬的導(dǎo)師譚蘭教授和關(guān)心、愛護(hù)、支持我工作～學(xué)習(xí)和生活的各位老師、同學(xué)和家人!譚夢(mèng)姍萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含未獲得——(洼!翅送直基絲盂垂塹剔重墮的!奎攔亙窒2或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的

2、說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：瀕嘶簽字日期：印c畢年fp月1日I學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，并同意以下事項(xiàng)：1、學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。2、學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)清華大學(xué)“中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社”用于出版和編入CNKI《中國(guó)知識(shí)資源總庫》，授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：嬤剪

3、槲簽字日期：p11年f、，月f日亟∥弘引夕么矗字期簽日’_h¨?7一師字導(dǎo)簽萬方數(shù)據(jù)靶向調(diào)節(jié)NLRPI炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡治療阿爾茨海默病靶向調(diào)節(jié)NLRPl炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡治療阿爾茨海默病摘要目的：研究NLRPl炎癥小體對(duì)13一淀粉樣蛋白(Amyloid—B，AB)誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元焦亡的作用，及其在阿爾茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)發(fā)生中的機(jī)制，探討靶向調(diào)節(jié)腦內(nèi)NLRPl炎癥小體對(duì)APPswe／PSldE9雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠認(rèn)知功能和腦內(nèi)神經(jīng)病理的影響。方法：1、離體層面：分離純化大鼠皮層神經(jīng)元，應(yīng)用不同濃度的AB。啦作用于神經(jīng)元，測(cè)定神經(jīng)元活力和乳

4、酸脫氫酶(LDH)釋放量，通過TIJNEL染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，ASC熒光染色，了解神經(jīng)元的焦亡情況；同時(shí)，采用免疫印跡法檢測(cè)ABⅧ作用下NLRPl表達(dá)、Caspase一1活性水平，ELISA檢測(cè)IL一1B表達(dá)水平。應(yīng)用小于擾RNA(siRNA)技術(shù)，了解NLRPl炎癥小體信號(hào)通路在A13。z誘導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡過程中的作用。2、活體層面：選取雄性3月、6月及9月齡APPswe／PSldE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠以及其對(duì)照同源野生小鼠，通過免疫印跡法、熒光共定位法測(cè)定腦組織神經(jīng)元中NLRPl隨年齡變化的表達(dá)情況。之后選取5月齡APPswe／PSldE9小鼠，隨機(jī)分為干擾組和對(duì)照組。干擾組于第三腦室通過

5、微型滲透泵持續(xù)輸注NLRPJ或Caspase一1siRNA(0．1】ul／h)以抑制腦內(nèi)NLRPI或Caspase一1的表達(dá)；對(duì)照組輸注對(duì)照siRNA(0．11u1／h)。6周后，干擾效率通過免疫印跡法以及RT-PCR法確認(rèn)。通過MorriS水迷宮測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。通過免疫印跡法測(cè)定腦中Caspase-1活性水平、IL-Ip表達(dá)水平的變化；通過TUNEL染色觀察小鼠皮層、海馬區(qū)神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞百分比變化，尼氏染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞漿中的尼氏小體(Nisslbody)變化，免疫組化觀察胞外淀粉樣斑的變化。結(jié)果：】、離體層面：5umol／LABH：與原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元共

6、同孵育24h誘導(dǎo)神經(jīng)元焦亡，表現(xiàn)為TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)增多，LDH釋放量增加，ASC斑形成；同時(shí)NLRPl表達(dá)水平升高，Caspase～l激活，IL一1B釋放增多。用NLRPIsiRNA對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元進(jìn)行預(yù)處理48h后再加入A13H，共同孵育，發(fā)現(xiàn)靶向抑制NLRPl對(duì)A13致神經(jīng)元焦亡損傷有明顯的保護(hù)作用，表現(xiàn)為TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)減少，LDH釋放量減低；同時(shí)活化態(tài)Caspase-1明顯降低，IL一1B釋放減少。2、活體層面：與同月齡對(duì)照小鼠相比，6月齡和9月齡APPswe／PSldE9小鼠腦神經(jīng)元中NLRPI水平顯著升高。給予NLRPl或Caspase-1siRNA6周能

7、降低APPswe／PSldE9小鼠腦內(nèi)NLRP]或Caspase一1萬方數(shù)據(jù)靶向調(diào)節(jié)NLR．P]炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元焦亡治療阿爾茨海默病水平約50一6096。同時(shí)，干擾組小鼠腦內(nèi)IL一113水平明顯降低；神經(jīng)元胞漿中Niss]body改變減輕、數(shù)量增多，神經(jīng)元TUNEL陽性細(xì)胞百分比減低，而胞外淀粉樣斑尚未見明顯變化。此外，MorriS水迷宮隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，干擾組小鼠尋找平臺(tái)潛伏期及游行距離較對(duì)照組明顯縮短；空間探索實(shí)驗(yàn)中，干擾組小鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間較對(duì)