黑龍江省南瓜病毒病毒原鑒定和品種資源抗性篩選的研究

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1、竺!．4：堂堡絲蘭墮亙一—』生坐堡坐．!：i二一擋：一起形成刪狀的病毒粒子集合體(brushlikevirusaggregates)(李向東，1998)。2．1．2寄主范圍和癥狀測定有些病毒組的特殊癥狀成為分類的特定依{J；i，同時還為病毒繁殖、提純和侵染性試驗提供依據(jù)。鑒別寄主要求接種后癥狀出現(xiàn)快而且穩(wěn)定，一種病毒的鑒別寄主最好是3種不同反應(yīng)物：a病毒不能侵染；b病毒侵染后表現(xiàn)系統(tǒng)侵染癥狀；c病毒侵染后表現(xiàn)局部病斑。其中局部病斑寄主對癇毒的侵染表現(xiàn)過敏反應(yīng)，病毒只能在侵染點形成典型的局部退綠斑、壞死斑或壞死環(huán)斑等。瓜類作物病毒病的鑒別寄主一般采用的是葫蘆科、茄科、豆科、黎利、莧

2、科等5科的一些利z。這些種都對一定的瓜類病毒病表現(xiàn)很好的局部病斑反應(yīng)。將栗自山東省平度縣、I臨沂市的病葉樣品加適量磷酸緩沖液，研磨后摩擦接種到莧色藜(Chenopodmmamaranticolor)上經(jīng)過三次單斑分離后得到兩個分離物W—PD、w-LY，W—PD經(jīng)過人工摩擦接種13科38種植物，可侵染其中的3科8種植物，w—LY接種11科19種植物，可侵染5科13種植物(李向東，1995)。2．1．3傳播方式傳播方式是分類的重要指標，如汁液、種傳、介體傳播特性等。將田間采集的桃蚜饑餓24h后，在甜瓜病葉上飼喂3h，再移到健康甜瓜苗上(子葉期)經(jīng)觀察，甜瓜未感病，表明南瓜花葉病毒不能

3、由蚜蟲傳播(陳京，1996)。黃瓜花葉病毒可由60種蚜蟲以口針攜帶的方式傳播，蚜蟲可在5-10min內(nèi)獲毒，并能保持傳播2h。也可由機械傳播，19種作物的種子可傳毒；西瓜花葉病毒2號可由20種蚜蟲傳播，也能通過機械方式傳播(PProvvideoti，1986)。2．1．4病毒細胞病理學鑒定病毒侵染引起寄主的病理變化，大多數(shù)病毒組在植物體內(nèi)有其特有的內(nèi)含體。在西瓜病葉組織薄切片內(nèi)有風輪狀、環(huán)狀內(nèi)含體及彎曲線狀病毒粒子(李向東，1995)。在電鏡下觀察黃瓜花葉病毒(cMv)的侵染擴散部位發(fā)現(xiàn)：病毒粒體入侵細胞及復制子代粒體的擴散同煙草花葉病毒有直接穿過薄壁入胞的現(xiàn)象。寄主植物在病毒入

4、侵后，除了外觀上出現(xiàn)病斑，葉片細胞的結(jié)構(gòu)，尤其是葉綠體病變明顯，如：外膜不完整、片層松散、結(jié)構(gòu)刖，脹，嚴重時會使整個葉綠體解體，另外，細胞質(zhì)中還出現(xiàn)許多高爾基囊泡等超微結(jié)構(gòu)的影響(胡向武，1998)。2．1．5病毒粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及其特性這是病毒鑒定的關(guān)鍵指標，包括構(gòu)成病毒基因組的核酸類型、核酸鏈性、核營酸數(shù)日、大小、堿基組成和序列及病毒外殼蛋白特性，免疫血清學特性等。在電鏡下能觀察到很多均勻一致的多面體病毒直徑28rtm。SDS—PAGE電泳結(jié)果看出，甜瓜一US和甜瓜．1兩個分離物的外殼蛋自理基譜帶是完全相同的，都具有一個蛋白亞基，根據(jù)標準曲線及病毒外殼蛋白亞基譜帶的相對遷移率測定

5、，大亞基分子量約42000道爾頓，小亞基約22000道爾頓，與已報道的南瓜花葉病毒外殼蛋白亞基分子量一致(RNCampheu，1972：田國忠，1989；陳京，1996)。用雙脫氧鏈終止法分析克隆的番木瓜環(huán)斑病毒(PRV)Ys株系外殼蛋白(印)基因的序列，結(jié)果表明Yscp基因全長858nt。對PRV國內(nèi)外165塑!：蘭垡墮蘭塑童——蔓!生墨些!!!二個株系或分離物cp基閃的比較發(fā)現(xiàn)，Ysep基因。引蜀內(nèi)株系或分離物cp基因的同源性較高9944％--9768％(JJlr長明等，1997)。從赤豆病株上得到一癇毒分離物RBl用聚丙烯酰胺凝膠電泳測得其衣殼蛋白亞基分子量28kDa，分析

6、植物組織I扣dsRNA，發(fā)現(xiàn)有四條dsRNA條帶，長分別為3．3，3．0，2．2和0．9kb，根據(jù)結(jié)果被鑒定為黃瓜花葉病毒(CMV)(康霄文，1999)。2．1．6電鏡技術(shù)隨著病毒提純條件的改善，超薄切片技術(shù)的發(fā)展，電予顯微鏡診斷已成為鑒定植物病毒不可缺少的重要手段。現(xiàn)在不僅從提純的病毒制劑中觀察病毒粒體，而且j丕從介體和感病組織的超薄切片中觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)與內(nèi)含體等。在電鏡下觀察黃瓜花葉病毒(CMV)的侵染擴散部位發(fā)現(xiàn)：病毒粒體入侵細胞及復制子代粒體的擴散同煙草花葉病毒有直接穿過薄壁入胞的現(xiàn)象，病毒粒子成球形，直徑28~30nm(張仲凱，1998)。血清學與電鏡相結(jié)合的免疫電

7、鏡技術(shù)(SEM)，集中了兩種方法的靈敏度和直觀性，農(nóng)業(yè)部植物檢疫實驗所采用了免疫電鏡檢測煙草環(huán)斑病毒的檢疫檢測方}去(陳燕芳等，1999)。自從Faulk和Taylor(1971)首次將膠體金用于電子顯微鏡作為免疫染色體標記。最近建立了膠體金免疫電鏡技術(shù)，隨著單克隆抗體eDNA探針的使用，膠體金可與單克隆抗體結(jié)合使用，提高靈敏度，以及通過eDNA探針技術(shù)成為檢測植物病毒蛋白和核酸的一種有用工具(成卓敏，1995)。把膠體金作為在電鏡下示蹤的標志，已成功地快速檢測和鑒定了病汁液中線