鴨圓環(huán)病毒四川毒株的進化分析及感染性分子克隆的構建

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1、萬方數(shù)據(jù)論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，學位論文中不包含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學或其它教育機構的學位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：粥忐2。f牛年(月f『D日關于論文使用授權的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論

2、文。同意四川農(nóng)業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名：孑杉志之導師簽名．嘛孺．≯l忙《只ioBpfp每6其《。日萬方數(shù)據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文本論文的創(chuàng)新性工作1．鴨圓環(huán)病毒四川毒株GH01的首次分離、鑒定及全基因組序列分析：從四川廣漢某鴨場分離獲得鴨圓環(huán)病毒，命名為GH01株，對GenBank上所有DuCV進行分析，表明鴨圓環(huán)病毒可分為2個基因型(DuCV—l和DuCV一2)與6個亞型0a,lb，lc，2a，2b和2c)，并證明了四川GH01株鴨圓環(huán)病毒是由早期病毒株經(jīng)歷基因組變異演化而來，基因重組以及選擇壓力的凈化壓力在鴨圓環(huán)病毒進化過程中起到重要

3、作用。2．利用反向遺傳學進行鴨圓環(huán)病毒病毒拯救：通過鴨圓環(huán)病毒的全基因組擴增及雙拷貝連接載體構建攜帶遺傳標記的感染性克隆plC—Mu2DuCV，經(jīng)試驗動物表明，構建的感染性克隆可以拯救出完整鴨圓環(huán)病毒，并命名為PMDC，并對拯救毒株PMDC進行了部分生物學特性分析。一㈣2一腫1㈣m㈣糾唧1～㈣塑萬方數(shù)據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文中文摘要鴨圓環(huán)病毒(Duckcircovirus，DuCV)是近年來新發(fā)現(xiàn)的水禽感染性病原，造成鴨生長遲緩，體重下降等癥狀。病毒主要侵染鴨淋巴器官，患鴨后會引發(fā)免疫抑制及可能的二次感染，對養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。因此，分析我國DuCV的遺傳演化規(guī)律并構建體外轉(zhuǎn)錄的模型

4、具有十分重要的科學意義。1．DuCV的分離、鑒定及全基因組序列分析本研究從疑似感染DuCV的病鴨體內(nèi)分離到一株DuCV(命名為DuCV-GH01)，通過PCR得到病毒全基因組進行序列分析表明，DuCV．GH01的核苷酸序列與目前GenBank登錄的所有DuCV序列相似性高達81．8％～99．4％，根據(jù)PASC的P值／頻率分布圖獲得，當不同基因組的P值大于0．170時，可分為DuCVl和DuCV2；當DuCVl和DuCV2的型間P值大于0．032或0．018時，可以將鴨圓環(huán)病毒細分為1a、1b、1c和2a、2b、2c6個亞型。這個結果證明DuCV由一個共同祖先經(jīng)過不同的進化過程分化為DuCV-1

5、和DuCV-2。2．DuCV的基因重組及選擇壓力分析通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)利用全基因組進行分型時的3株DuCV-2a毒株(GenBankNo．EU344802、EU344805和EU499309)在利用Rep基因進行基因分型時結果不同。通過分析發(fā)現(xiàn)，是由于這3株毒株的Rep基因的第71至581位堿基序列與DuCV-1a的相同區(qū)域的堿基序列發(fā)生了重組。利用基因重組分析軟件獲得DuCV的5個主要基因重組事件，且重組主要發(fā)生非結構蛋白Rep和結構蛋白Cap的編碼區(qū)，DuCV利用基因重組增加其基因組的多樣性。通過對DuCVl型和2型的抗原表位以及糖基化位點分析，表明DuCVl型和DuCV2型的氨基酸的

6、差異，可能造成DuCVl型的抗原性稍強于DuCV2型的抗原性，使其所受到的免疫壓力更大。此外，經(jīng)分析選擇壓力中的凈化選擇壓也在DuCV的進化中起到了重要的作用。3．DuCV反向遺傳學平臺的建立及其病毒拯救為了構建含有遺傳標記的感染性克隆，進一步研究鴨圓環(huán)病毒的致病機制。本研究利用PCR擴增鴨圓環(huán)病毒GH01株全基因組CG，將2個基因組IC．1、IC．2順式連接插入到pUCl9載體中獲得串連雙拷貝重組質(zhì)粒plC一2DuCV，并通過同義突變引入酶切標記位點XhoI獲得plC-Mu2DuCV。重組質(zhì)粒plC-Mu2DuCV經(jīng)過＆D對線性化，以100rtg／kgDNA和200pa／kg的脂質(zhì)體肌肉注射

7、10日齡DuCV陰性雛鴨。結果顯示，成功構建含有分子萬方數(shù)據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文標記XhoI的串連雙拷貝重組質(zhì)粒plC—Mu2DuCV，經(jīng)肌肉注射雛鴨轉(zhuǎn)染組于轉(zhuǎn)染21d后檢出血清陽性，并通過測序經(jīng)XhoI標記位點將拯救出的病毒與野生毒株進行區(qū)分。本試驗構建的DuCV全長基因組頭尾串聯(lián)二聚體感染性克隆DNA可以轉(zhuǎn)染雛鴨并增殖出帶標記的DuCV病毒，為進一步研究DuCV分子特性和致病機理打下了基礎