daple基因在鼠腦內(nèi)及體內(nèi)的空間分布表達

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1、學(xué)校代碼：10023學(xué)號：200501067Daple基因在鼠腦內(nèi)及體內(nèi)的空間分布表達專業(yè)年級：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)05級姓名：王亭睿導(dǎo)師：王任直(教授)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院(北京協(xié)和醫(yī)院)神經(jīng)外科完成日期：2013年6月㈣中文摘要????????????????????????????????4前言????????????????????????????????????????8材料和方法?????????????????????????????11結(jié)論與討論??????????????????????????????．4S致謝????????????????????????

2、???????????????????????????．51獨創(chuàng)性聲明與學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書?????????????????．S3縮略詞表英文縮寫英文全名中文全稱ATPadenosinetriphosphate三磷酸腺菅cDNACTPDEPCDNADTTEDTAGTPPCRPBSRNAcomplementaryDNAcytidinetriphosphatediethylpyrocarbonatedeoxyribonucleicaciddithiothreitolethylenediaminetetraaceticacidguanosinetriphosphatepolymerase

3、chainreactionphosphatebufferedsalineribonucleicacid互補脫氧核糖核酸三磷酸胞苷焦碳酸二乙酯脫氧核糖核酸二硫蘇糖醇乙二胺四乙酸三磷酸鳥苷多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)磷酸鹽緩沖液核糖核酸3中文摘要研究目的：Daple又稱為含有高亮氨酸殘基的Dvl相關(guān)蛋白。Daple是Girdin家族的基因(Girdin，Daple，F(xiàn)LJ004354)。其中Daple和Girdin在N端有很大的同源性，(54％的氨基酸相同)，意味著兩個基因功能相似，而C末端則與Girdin較少的相似性，只有27％，這意味著Daple具有不同于Girdin的特殊功能。Daple在Wnt經(jīng)

4、典途徑中抑制B．catenin聚集和T細胞因子(Tcf)的轉(zhuǎn)錄活性，起負調(diào)節(jié)作用。而在非經(jīng)典Wnt通路中增加蛋白激酶C(PKC)與Dvl互相作用激活Rac蛋白，起正調(diào)節(jié)作用。目前已知Daple在出生后期細胞遷移中起著重要的作用，Daple可能會影響胚胎發(fā)育、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展。目前哺乳動物Daple的分布表達的仍不明確。因此，全面了解Daple蛋白的功能及分布對于進一步了解相關(guān)疾病的發(fā)病機制及預(yù)后有重要意義。本研究重點是Daple基因的表達分布。材料與方法：通過SA剪接受體技術(shù)制作的Daple基因敲除的老鼠購自transgenic公司。出生7天的老鼠(p7；雌性)和8周老鼠(p56；雄

5、性)(野生型老鼠(+／+)同源性老鼠(．／．))用4％PFA灌注，解剖出組織、冰凍、冰凍切片，解凍安裝在載玻片上。Daple分布可以通過LacZ染色顯示并可以應(yīng)用原位雜交技術(shù)驗證LacZ染色的結(jié)果。用33p或地高辛標(biāo)記的DaplecRNA探針(外顯子30)。根據(jù)daple基因在腦中的分布，進一步對神經(jīng)進行免疫組化染色，用PGP9．5，GFAP標(biāo)記，判定daple基因是在神經(jīng)元或是膠質(zhì)細胞表達。根據(jù)其分布的特點對腦內(nèi)可能出現(xiàn)的異常酶進行PCR和RT．PCR分析。結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)LacZ染色的p7和p56的同源性Daple敲除的小鼠在紋狀體、腦室室管膜細胞、小腦(大概在皮質(zhì)上的浦肯野細胞)、

6、海馬、嗅球、脊髓、氣管、膀胱、毛囊、舌、胃、脾、胰腺、心肌細胞、視網(wǎng)膜、腎乳頭和門靜脈，beta-geo(Daple啟動子介導(dǎo)LacZ和抗新霉素基因融合】表達而野生型小鼠不表達。原位雜交技術(shù)也證實了這個結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)在脈絡(luò)叢和海馬CA3區(qū)，Daple在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達，而在紋狀體中，Daple同時在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞中表達。酪氨酸羥化酶(TH)RT．PCR和realtimePCR的結(jié)果顯示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羥化酶表達中并沒有顯著性差異。結(jié)論：我們成功的描述出Daple的基因表達。Daple在腦、脊髓、眼、膀胱上皮及平滑肌、支氣管上皮、胃、。腎臟、睪丸、輸精管

7、、毛囊、舌、門靜脈表達顯著。Daple4在小鼠腦中的分布主要在紋狀體、海馬、齒狀回、皮質(zhì)、黑質(zhì)和室管膜細胞上。在脈絡(luò)叢和海馬CA3區(qū)，Daple在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達，在紋狀體中Daple同時在膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞中表達。通過酪氨酸羥化酶PCR的結(jié)果顯示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羥化酶表達中并沒有顯著性差異，提示同源型敲除小鼠中多巴胺含量與野生型小鼠區(qū)別不大。希望通過了解Daple在小鼠全身器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布情況，可以更清楚地