大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

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1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究姓名：徐亞平申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：范靜平201205大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究目的摘要通過體外原代及傳代培養(yǎng)大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞，優(yōu)化體外培養(yǎng)條件，并獲得具有多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞球，觀察嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖特點(diǎn)，將嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞與體外培養(yǎng)的毛細(xì)胞或耳蝸培養(yǎng)液共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)分化為耳蝸毛細(xì)胞，探索嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞治療感音神經(jīng)性耳聾提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)及可行性。刀活1、大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外原代、傳代培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)：雄性250．3009健康大鼠1．2只，C02

2、窒息死亡，斷頭后取雙側(cè)鼻甲及篩板，將鼻粘膜玻璃放入培養(yǎng)皿中，將嗅黏膜組織塊用中性蛋白酶消化后，顯微鑷將嗅黏膜上皮層與固有層分離開，巴爾德斯管將上皮層輕輕吹打，固有層用膠原酶消化后，將上皮層與固有層混合后，輕輕吹打，1000r／s離心10min后，用含10％FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液重懸，于培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，2．3天換一次液。傳代培養(yǎng)：含10％FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液原代培養(yǎng)8．12天后，將貼壁細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞密度為5x104個(gè)／cm2種植于己用PLL包被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)液換為無血清促增殖培養(yǎng)液：DMEM／F12、l％ITS、20ng／mlbFGF、4

3、0ng／mlEGF、青霉素一鏈霉素。每2．3天換液一次。純化：含10％FBS的DMEM／F12培養(yǎng)液重懸時(shí)，培養(yǎng)皿不需要任何物質(zhì)包被，避免雜細(xì)胞混合在一起貼壁。間接免疫細(xì)胞化學(xué)：嗅黏膜基底細(xì)胞(嗅神經(jīng)干細(xì)胞)分為球狀基底細(xì)胞(GBCs)和水平狀基底細(xì)胞(HBCs)，間接免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色方法用抗體GBC．2標(biāo)記球狀基底細(xì)胞(GBCs)，用抗體cytokeratin5標(biāo)記水平狀基底細(xì)胞(HBCs)。將傳代形成神經(jīng)球從貼壁狀態(tài)胰酶消化成懸浮狀態(tài)，后將懸浮球貼壁于另一PLL包被的培養(yǎng)皿中，用含10％FBS的DMEM／F12培養(yǎng)一周，TUJl、S100、GFAP和P75標(biāo)記嗅上皮神經(jīng)球分化來

4、的細(xì)胞。2、耳蝸細(xì)胞培養(yǎng)及與嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)與鑒定耳蝸細(xì)胞培養(yǎng)：按照嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法：取材．組織消化．貼壁培養(yǎng)；培養(yǎng)液為：DMEM／F12、2％B27、青霉素．鏈霉素，每兩天換液一次。第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文耳蝸組織培養(yǎng)液收集：取新生大鼠取出聽上皮基底膜，采用組織培養(yǎng)法，培養(yǎng)液為：含有青霉素．鏈霉素的DMEM／F12；每天換液，并收集條件培液(CM)，濾器過濾后保存于．80℃?zhèn)溆?。嗅神?jīng)干細(xì)胞與耳蝸細(xì)胞共培養(yǎng)：細(xì)胞復(fù)蘇或傳代培養(yǎng)后所得單細(xì)胞懸液于PLL包被的玻片上貼壁，耳蝸細(xì)胞同樣貼壁于玻片上，將有嗅神經(jīng)干細(xì)胞及毛細(xì)胞的玻片置于同一培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為：含有青霉素．鏈霉

5、素的DMEM／F12。每兩天換液一次，培養(yǎng)20天后，間接免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色鑒定。或者貼壁的嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞加入CM培養(yǎng)液，每天換液一次，培養(yǎng)20天后，間接免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色鑒定。圣士里拿日7卜l、大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外原代、傳代培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)時(shí)種植后1天，只有少量細(xì)胞貼壁，大部分細(xì)胞都懸浮，含10％FBS的DMEM／F12培養(yǎng)8．12天，細(xì)胞長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，傳代培養(yǎng)液(DFl2+1％ITS+20ng／mlbFGF+40ng／mlEGF)貼壁培養(yǎng)lO一14天后，細(xì)胞開始出現(xiàn)增殖，形成增殖球。傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)l周后能形成增殖球。原代培養(yǎng)1天后，少量貼壁細(xì)胞cytokerati

6、n5陽性，原代培養(yǎng)3天后貼壁細(xì)胞增殖形成細(xì)胞集落，集落中細(xì)胞形態(tài)大小不一，有的呈圓形，有的呈梭形，還可見不規(guī)則含突起細(xì)胞，集落周邊細(xì)胞向四周遷移。對原代貼壁培養(yǎng)3天細(xì)胞染色，顯示集落靠中央處細(xì)胞呈cytokeratin5陽性、GBC．2陽性，集落周邊細(xì)胞只呈GBC．2陽性。8天后幾乎所有細(xì)胞呈GBC．2陽性，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，并可見細(xì)胞融合。增殖球重貼壁2天后可見有細(xì)胞從球邊緣向四周遷移，1周后細(xì)胞許多細(xì)胞已完全遷出增殖球，呈長梭形。這些細(xì)胞可有TU兒、S100、GFAP和P75陽性，這說明體外培養(yǎng)的嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞具有分化多潛能性。2、大鼠嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖特點(diǎn)原代貼壁培養(yǎng)增殖

7、的細(xì)胞為HBCs，組織來源的GBCs細(xì)胞體外培養(yǎng)不增殖，由HBCs分化而來的GBCs可在含lO％FBS培養(yǎng)液中快速增殖，而HBCs能在無血清促增殖培養(yǎng)基中保持增殖狀態(tài)不趨于分化。在含血清培養(yǎng)基快速增殖的GBCs傳代后，以適宜密度種植于培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后細(xì)胞開始聚集，聚集的中心位置開始形成增殖球，并逐漸增大，增殖球中含有cytokeratin5陽性的HBCs。3、耳蝸細(xì)胞培養(yǎng)及與嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)與鑒定耳蝸細(xì)胞培養(yǎng)：原代