j亞群禽白血病病毒表面糖蛋白su和兔igfc融合蛋白的表達(dá)及初步應(yīng)用

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1、J亞群禽白血病病毒表面糖蛋白SU和兔IgGFc融合蛋白的表達(dá)及初步應(yīng)用ExpressionandapplicationofsubgroupJavianleukosisvirusSUproteinfusedtotheFcofrabbitIgG研究生：孫薇薇導(dǎo)師：秦愛建教授資助項(xiàng)目：聯(lián)合國家基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U0831002)長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT0978)國家基金青年項(xiàng)目(31201881)江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科揚(yáng)州大學(xué)2013年6月孫薇薇：J亞群禽白血病病毒SU和兔IgGFc融合基因的表達(dá)及初步應(yīng)用J亞群禽白血病病毒表面糖蛋白SU和兔IgGFc

2、融合蛋白的表達(dá)及初步應(yīng)用I掣III112III14IIHll9U12Iltll7lI噦研究生：孫薇薇導(dǎo)師：秦愛建教授摘要禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)是一種能引起禽類多種類型腫瘤的反轉(zhuǎn)錄病毒，包括A-J等10個(gè)亞群。其中J亞群禽白血病病毒(SubgroupJofavianleukosisvirus，ALV-J)是20世紀(jì)80年代末Payne等首先從肉雞中分離鑒定出來的亞群。自1999年我國首次分離ALV．J以來，ALV-J已從肉用雞群向蛋用型雞群和地方品系雞群傳播。這種傳播可能是因?yàn)榭乖儺愂笰Lv-J感染特性和宿

3、主范圍發(fā)生了改變。囊膜蛋白(Envelopeprotein)是決定ALv-J宿主范圍的關(guān)鍵因素，其中表面糖蛋白gp85(SU)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合。ALv．J的SU蛋白基因序列存在不同程度變異，且變異程度較其他亞群高，這可能導(dǎo)致ALv_J的細(xì)胞嗜性和細(xì)胞受體種類發(fā)生變化，繼而影響到病毒的宿主范圍。因此，獲得一種能夠用于分離鑒定病毒受體的誘餌蛋白至關(guān)重要。本研究通過兩種真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ALv-JSU和兔IgGFc融合蛋白，為ALV-J受體的研究提供工具。繼而以SUJ．IgGFc融合蛋白為工具，利用免疫共沉淀方法捕獲易感細(xì)胞受體蛋白，為研究細(xì)胞

4、受體在病毒感染過程中的作用以及病毒感染的入侵機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1．舢ⅣJSU和免IgGFc融合基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其初步應(yīng)用為了獲得ALv-JSU和兔IgGFc的融合蛋白，用于研究ALV-J與宿主的相互作用，本研究用己構(gòu)建的pcDNA3．1-SUJ．IgGFc為模板，用PCR方法擴(kuò)增出SUJ．IgGFc基因，并克隆至pFastBacl質(zhì)粒，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBacl．SUJ．IgGFc；再將其轉(zhuǎn)化DHl0BacTM感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid．SUJ．IgGFc；最后在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀

5、病毒rBac．SUJ．IgGFc。免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組桿狀病毒表揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文2達(dá)的融合蛋白可被ALV_J單抗JE9以及羊抗兔IgG全分子所識(shí)別。Westernblot結(jié)果顯示，表達(dá)的融合蛋白的分子量大小約95kDa。該融合蛋白的表達(dá)為細(xì)胞表面ALV-J受體的研究提供了有力工具。用常規(guī)蛋白提取法提取ALV．J易感細(xì)胞DFl的總蛋白，以純化的SUJ．IgGFc融合蛋白為工具，應(yīng)用免疫沉淀的方法捕獲ALV-J受體蛋白，結(jié)果獲得兩種差異蛋白，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定分別為中心體蛋t芻(Centrosomalprotein)和II型角蛋白細(xì)胞骨架l類

6、似物(keratin，typeIIcytoskeletall-like)，二者與已報(bào)道的ALv-J受體chNHEl不相符。這一結(jié)果提示DFl細(xì)胞可能存在除NHE．1受體之外能與SU結(jié)合的蛋白。2．舢ⅣJSU和兔IgGFc融合基因在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其初步應(yīng)用鑒于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)表達(dá)蛋白修飾的特點(diǎn)，在使用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)某些蛋白時(shí)無法保持天然狀態(tài)，可能會(huì)影響互作蛋白的識(shí)別。因此，為了獲得更接近天然特性的SU．IgGFc融合蛋白，本研究將SUJ—IgGFc融合基因克隆到pShuttle．CMV中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle—CMV

7、-SUJ．IgGFc；將PmeI線性化處理的重組質(zhì)粒與pAdEasy．1共轉(zhuǎn)化BJ5183．AD．1細(xì)胞，經(jīng)同源重組及抗性篩選和酶切鑒定得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd．SUJ．IgGFc。再將Pacl線性化的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到重組腺病毒rAd．SUJ．IgGFc。經(jīng)PCR鑒定證實(shí)重組腺病毒含SUJ．IgGFc基因。同時(shí)免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組腺病毒在293T細(xì)胞得到表達(dá)，且表達(dá)的融合蛋白可被ALv-J單抗JE9以及羊抗兔IgG全分子所識(shí)別。Westernblot結(jié)果表明，融合蛋白分子量大小約為95kDa，且與JE9單抗以及羊抗兔I

8、gG全分子都有很好的反應(yīng)性。以上結(jié)果證實(shí)，本研究成功構(gòu)建了重組腺病毒表達(dá)載體rAd．SUJ．IgGFc，并在293T、MDCK等真核細(xì)胞中大量表達(dá)，為