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《甜瓜α-甘露糖苷酶基因的克隆、表達(dá)特性及功能分析》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)校代碼：10126分類號G78UDC577論文題目學(xué)號：92100807編號甜瓜a—甘露糖苷酶基因的克隆、表達(dá)特性及功能分析所在學(xué)院：專業(yè)：研究方向：研究生：指導(dǎo)教師：2014年05月25日一塑凰一墅墮生一基一螢一蛀堂王盈鰱■堂金蘭鶘一堇整盞塑牲直盒堂生一型盟生一絲王畦塹一塑垃彗監(jiān)原創(chuàng)性聲明本人聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn){亍的研究工作及取得的研究成果。除本文已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得出塞查盍堂及其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證
2、書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：必!墊璺必絲幽指導(dǎo)教師簽名：瞳塑礎(chǔ)荔日期：刪．f．戈f日期：動·燁。，、三歹在學(xué)期間研究成果使用承諾書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：內(nèi)蒙古大學(xué)有權(quán)將學(xué)位論文的全部內(nèi)容或部分保留并向國家有關(guān)機(jī)構(gòu)、部門送交學(xué)位論文的復(fù)印件和磁盤，允許編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，也可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。為保護(hù)學(xué)院和導(dǎo)師的知識產(chǎn)權(quán)，作者在學(xué)期間取得的研究成果屬于內(nèi)蒙古大
3、學(xué)。作者今后使用涉及在學(xué)期間主要研究內(nèi)容或研究成果，須征得內(nèi)蒙古大學(xué)就讀期間導(dǎo)師的同意；若用}二發(fā)表論：文=，版權(quán)單位必須署名為內(nèi)蒙古大學(xué)方可投稿或公開發(fā)表。學(xué)位論文作者簽名：箋熟墅查堡堡勘魚掣指導(dǎo)教師簽名j飆絲塑：主：塹日期甜瓜Q一甘露糖苷酶基因克隆、表達(dá)特性及功能分析摘要甜瓜是具有重要商業(yè)價(jià)值的園藝作物，對于消費(fèi)者來說，它的品質(zhì)是一個(gè)重要的質(zhì)量屬性。甜瓜果實(shí)中含有香味揮發(fā)物、可溶性糖、有機(jī)酸、色素、次生代謝物等，可以提供很多人類的日常飲食營養(yǎng)，因此受到人們的喜愛。甜瓜果實(shí)不耐貯運(yùn)，貨架期相對較短，在運(yùn)輸和銷售
4、過程中伴隨著果實(shí)的成熟和軟化，損失加劇。而且，采摘后果實(shí)過度軟化引起皺縮、干燥和霉變，嚴(yán)重降低了甜瓜果實(shí)的質(zhì)量和感觀性狀。0【一甘露糖苷酶(O【一mannosidase)是一類關(guān)鍵性糖苷酶，由很多成員組成。它的功能是修剪糖蛋白糖鏈中的不同甘露糖基，它不僅在糖蛋白的形成過程中發(fā)揮重要作用，并且參與果實(shí)的成熟與軟化。為了研究甜瓜僅一甘露糖苷酶基因(僅．Man)在果實(shí)發(fā)育成熟中的功能，本論文以甜瓜品種河套蜜瓜為研究材料，克隆了甜瓜果實(shí)中的19c．Man基因全長cDNA。測定了甜瓜根、莖、葉、子房等不同組織和不同發(fā)育時(shí)期
5、的果實(shí)中僅一甘露糖苷酶活性，結(jié)果表明在子房中的酶活性最低，根、莖、葉組織中的酶活性較高，約為子房中活性的3～5倍。授粉后10"～30d的果實(shí)中，其活性顯著下降，而授粉后40d果實(shí)果皮顏色變黃，其活性有所增加。RT-qPCR分析結(jié)果顯示，僅一Man基因在葉片中的表達(dá)量最高，子房中表達(dá)量最低，葉片中表達(dá)量約為子房中的表達(dá)量的6倍，授粉后lO'～30d僅．Man基因表達(dá)量顯著下降，而授基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101559)甜瓜a-甘露糖苷酶基因的克隆、表達(dá)特性及功能分析粉后40d果皮顏色變黃，其表達(dá)量有
6、所回升。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，分別將含僅一Man基因的超表達(dá)載體pPZP221一Man、RNAi載體pART-Manl和pART-Man2的農(nóng)桿菌菌液注射至成熟期甜瓜果實(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，并對其進(jìn)行了表達(dá)特性分析。3～5天時(shí)，注射超表達(dá)載體菌液的果實(shí)在注射部位出現(xiàn)了提前變黃的表型。5～7天時(shí)，注射RNAi載體菌液的果實(shí)在注射部位仍保持綠色(推遲變黃)。a．甘露糖苷酶活性測定結(jié)果顯示，與非注射部位相比，注射超表達(dá)載體的組織0【．甘露糖苷酶活性較高，而注射RNAi載體的組織僅．甘露糖苷酶活性較低。RT-qPCR
7、分析表明，在瞬時(shí)超表達(dá)僅一Man基因的果實(shí)組織中，僅一Man基因和ACS6等成熟相關(guān)基因表達(dá)水平增高，而在瞬時(shí)抑制僅一Man基因表達(dá)的果實(shí)組織中，這些基因表達(dá)水平有所下降，表明僅．Man基因具有促進(jìn)果實(shí)成熟的功能。應(yīng)用花粉管通道法轉(zhuǎn)化技術(shù)，分別將pPZP221一Man(Oe-Man)和pART-Manl(Ri—Man)載體導(dǎo)入甜瓜，經(jīng)PCR檢測證明外源基因已經(jīng)整合到受體植物的基因組中，分別獲得了T1代和T2代轉(zhuǎn)基因植株。與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗鸸舷啾?，轉(zhuǎn)Oe．ManTl代甜瓜果實(shí)提前10d成熟，6c—Man基因及成熟相關(guān)
8、基因表達(dá)量顯著提高，0【一甘露糖苷酶活性也顯著升高；轉(zhuǎn)尺i．ManlT2代甜瓜果實(shí)成熟期和采后貯藏期顯著延長，僅一Man基因和成熟相關(guān)基因表達(dá)量以及0【一甘露糖苷酶活性下降。結(jié)果表明，甜瓜0c—Man基因在甜瓜果實(shí)耐貯藏基因工程中具有重要應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：甜瓜(Cucumismelo)；僅．甘露糖苷酶基因；農(nóng)桿菌；瞬時(shí)表達(dá)；功能內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文CLONING,EXP
