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1、構(gòu)建高效利用纖維二糖釀酒酵母的研究EngineeringSaccharomycescerevisiaeforrapidcellobioseutilization學(xué)科專(zhuān)業(yè)：生物化工研究生：胡夢(mèng)龍指導(dǎo)教師：元英進(jìn)教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一四年六月萬(wàn)方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得天津大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)
2、均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說(shuō)明）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日萬(wàn)方數(shù)據(jù)摘要同步糖化發(fā)酵在纖維素乙醇的生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，但是在同步糖化發(fā)酵的過(guò)程中存
3、在兩個(gè)瓶頸問(wèn)題：酶解過(guò)程中產(chǎn)生的纖維二糖抑制纖維素酶的活性；釀酒酵母的最適發(fā)酵溫度與纖維素酶的最適溫度不匹配。在本研究中，表達(dá)纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CDT）和β-葡萄糖苷酶（BGL）的基因被整合到酵母質(zhì)粒pRS426上，將所得質(zhì)粒pRS426-cdt-1-gh1-1導(dǎo)入到工業(yè)釀酒酵母SyBE001601中獲得菌株SyBE001602。對(duì)菌株SyBE001602進(jìn)行進(jìn)化工程改造后得到菌株SyBE001603。與SyBE001602相比，SyBE001603的糖耗速率提高了1.8倍，達(dá)到2.35g/L/h，乙醇產(chǎn)率提升了
4、3.9倍，達(dá)到1.17g/L/h，CDT的基因表達(dá)量提升了5.74倍，BGL的基因表達(dá)量提升了0.21倍。將CDT與BGL的基因在五個(gè)實(shí)驗(yàn)室底盤(pán)菌株中進(jìn)行過(guò)表達(dá)以研究CDT與BGL的基因表達(dá)量對(duì)菌株纖維二糖利用能力的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CDT與BGL的基因都會(huì)提高菌株的纖維二糖利用能力，但是提高的程度與底盤(pán)菌株的基因背景有關(guān)。對(duì)菌株SyBE001603的發(fā)酵性能進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)菌株在38°C條件下纖維二糖利用速率與30°C條件下利用速率基本一致，在34°C條件下菌株具有最高的發(fā)酵速率，在42°C條件下依然可以在30小時(shí)
5、內(nèi)將糖耗完。當(dāng)纖維二糖濃度為80g/L時(shí)，在34°C條件菌株的纖維二糖消耗速率可以達(dá)到3.67g/L/h，在38°C條件仍可達(dá)到3.04g/L/h。在pH為4.5的環(huán)境中菌株仍然可以正常生長(zhǎng)，當(dāng)pH大于5時(shí)菌株具有較快的生長(zhǎng)速率。將菌株SyBE001603應(yīng)用于同步糖化發(fā)酵中，可以發(fā)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵過(guò)程中纖維二糖的積累被消除，纖維二糖對(duì)纖維素酶的抑制作用被解除，乙醇的產(chǎn)率顯著提高，最終乙醇的得率提高了23%。菌株SyBE001603對(duì)纖維素水解液中的抑制劑也具有一定的耐受能力。在纖維二糖作為單一碳源的條件下，菌株可
6、以分別耐受3g/L糠醛、1.5g/L苯酚、4g/L乙酸以及含有2g/L糠醛、0.8g/L苯酚、1.5g/L乙酸的復(fù)合抑制劑，有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。關(guān)鍵詞：纖維素乙醇纖維二糖工業(yè)菌株同步糖化發(fā)酵合成生物學(xué)萬(wàn)方數(shù)據(jù)ABSTRACTSimultaneoussaccharificationandfermentationiswidelyappliedintheproductionofcellulosicethanol.However,therearetwobottlenecksinthesimultaneoussaccha
7、rificationandfermentationprocess:theinhibitionoftheaccumulatedcellobioseoncellulasesandthemismatchbetweenthetemperaturesforenzymatichydrolysisandfermentation.Inthisstudy,genesencodingcellobiosetransporter(CDT)andβ-glucosidase(BGL)wereintegratedonthepRS426plas
8、midandintroducedintoanindustrialSaccharomycescerevisiaestrainSyBE001601.StrainSyBE001602wasobtainedandevolutionengineeringwascarriedouttoimprovethecellobioseutilizationcapacityofthestrain
