釀酒酵母木糖代謝工程中輔酶

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1、釀酒酵母木糖代謝工程中輔酶工程的研究進(jìn)展*摘要輔酶工程（cofactorengineering）是代謝工程的一個(gè)重要分支，它通過改變輔酶的再生途徑，達(dá)到改變細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物構(gòu)成的目的。介紹了釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)木糖代謝工程中，利用輔酶工程解決氧化還原平衡問題的研究進(jìn)展，包括引入轉(zhuǎn)氫酶系統(tǒng)，增加代謝中可利用的NADPH，實(shí)現(xiàn)NADH的厭氧氧化等策略。同時(shí)介紹了改變XR、XDH輔酶偏好的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞:輔酶工程木糖酒精釀酒酵母氧化還原輔酶工程（cofactore

2、ngineering），是代謝工程的一個(gè)重要分支。利用分子生物學(xué)技術(shù)，改造細(xì)胞內(nèi)代謝途徑，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)輔酶的再生［1］，改變輔酶氧化還原態(tài)的比率，從而改變細(xì)胞的代謝功能及氧化還原酶催化的產(chǎn)物構(gòu)成。隨著代謝工程的廣泛應(yīng)用，代謝流改造過程中目標(biāo)產(chǎn)物得率不高，副產(chǎn)物積累的問題日趨顯現(xiàn)，其產(chǎn)生的原因之一就是代謝網(wǎng)絡(luò)的輔酶氧化還原的不平衡，為此在代謝工程研究過程中，必須對(duì)微生物代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行準(zhǔn)確分析，在改變代謝途徑的同時(shí)，要考慮整個(gè)代謝過程的平衡，尤其是輔酶的平衡。根據(jù)代謝工程（MetabolicE

3、ngineering）原理，利用分子生物學(xué)技術(shù)，拓展傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的發(fā)酵底物，以最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精，是隨著燃料乙醇廣泛推廣應(yīng)用，而備受關(guān)注的問題之一。木糖是木質(zhì)纖維水解液中含量?jī)H次于葡萄糖的單糖。釀酒酵母由于缺乏轉(zhuǎn)化木糖為木酮糖的酶系，不能利用木糖，但能利用其異構(gòu)體木酮糖。木糖異構(gòu)酶（xyloseisomerase,XI）可以催化木糖形成木酮糖，目前只有來源于嗜熱古菌Thermusthermophilus［2］及低等真菌Pi

4、romycessp［3］的木糖異構(gòu)酶基因xylA在釀酒酵母中得到了活性表達(dá)。多年來，在釀酒酵母中建立木糖向木酮糖轉(zhuǎn)化途徑的工作，主要是通過引入樹干畢赤氏酵母（Pichiastipitis）的木糖還原酶(xylosereductase,XR)和木糖醇脫氫酶(xylitoldehydrogenase,XDH)基因XYL1和XYL2來實(shí)現(xiàn)的［4］。雖然代謝工程菌株有較高的木糖利用率，但在發(fā)酵過程中，中間產(chǎn)物木糖醇積累［4］，代謝流不能很好地向下進(jìn)行，已成為釀酒酵母木糖代謝工程菌生產(chǎn)乙醇的瓶頸問題。其主

5、要原因是XR和XDH的輔酶分別傾向于NADPH和NAD+（圖1），一方面這兩個(gè)輔酶在釀酒酵母中不能直接轉(zhuǎn)化，其再生過程彼此獨(dú)立，造成了細(xì)胞內(nèi)輔酶氧化還原的不平衡，另一方面，在乙醇發(fā)酵的氧限制條件下，酵母細(xì)胞內(nèi)NADH積累，不能及時(shí)還原成XDH所需的輔酶NAD+，使得中間產(chǎn)物木糖醇積累，影響乙醇得率的提高。利用輔酶工程手段，改變細(xì)胞內(nèi)輔酶的比率，實(shí)現(xiàn)輔酶的再生，是解決這一問題的有效措施之一。1輔酶在酵母中的作用及轉(zhuǎn)化形式煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是代謝

6、中的重要輔酶，釀酒酵母中由于缺乏轉(zhuǎn)氫酶，二者的代謝是不相偶聯(lián)的，作用也不同，NADH主要用于分解代謝，而NADPH則主要參與合成代謝。圖1真菌木糖代謝流程圖Fig.1Xylosemetabolicpathwayinfungi在釀酒酵母中，糖分解及代謝產(chǎn)物生產(chǎn)過程產(chǎn)生大量NADH。為了維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和代謝流順利進(jìn)行，NADH氧化還原必須保持平衡。在好氧生長(zhǎng)條件下，酵母中NADH的氧化可以通過線粒體膜上的電子傳遞鏈實(shí)現(xiàn)；而在氧缺乏條件下，NADH不能通過線粒體電子傳遞鏈被氧化，NAD+再生受阻，細(xì)

7、胞需通過糖酵解過程中的產(chǎn)物如磷酸二羥丙酮作為內(nèi)源電子受體再生細(xì)胞質(zhì)中的NAD+，從而造成甘油等代謝產(chǎn)物的積累。在引入XR、XDH途徑的重組釀酒酵母工程菌，在限氧條件下NADH積累導(dǎo)致木糖醇的大量產(chǎn)生。NADPH是還原力的主要來源，在釀酒酵母中，NADPH產(chǎn)生主要來源于磷酸戊糖途徑，而消耗主要用于合成代謝，包括脂類的合成，氨基酸、核酸的合成等。2輔酶工程在重組釀酒酵母木糖代謝途徑中的應(yīng)用為了有效生產(chǎn)酒精，并減少木糖醇等副產(chǎn)物積累，釀酒酵母木糖代謝工程的一個(gè)重要方面就是解決輔酶的氧化還原平衡問題。目

8、前，已有利用輔酶工程在大腸桿菌（Escherichiacoli）［5~7］和乳酸菌（Lactococcuslactis）［8］細(xì)胞內(nèi)改造NADH氧化還原狀態(tài)的成功報(bào)道。對(duì)于釀酒酵母輔酶代謝的改造，國(guó)外也已有相關(guān)嘗試和研究，有的已經(jīng)取得了比較良好的效果，主要集中在以下幾個(gè)方面。2.1引入轉(zhuǎn)氫酶2.1.1引入外源轉(zhuǎn)氫酶轉(zhuǎn)氫酶（Transhydrogenase）是一種直接催化兩種輔酶之間可逆轉(zhuǎn)換的酶［9］（圖2）。它有兩種存在形式，一種是膜定位嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，通常催化圖2中<1>的反應(yīng)方向，同時(shí)消耗