壯筋續(xù)骨湯對骨折大鼠血清gh水平骨痂組織ghr表達(dá)的影響

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1、萬方數(shù)據(jù)第一章材料與方法生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，TC．120型，湖北泰維科技公司；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)TB一718型，湖北泰維科技公司；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(冷臺)，TB一718型，湖北泰維科技公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，HH．B11，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；紅外線干燥箱，YHG400型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠：隔水式電熱恒溫箱，PYX．DHS—X，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；微量移液器，10．1009LGilson，法國。1．2方法1．2．1建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)大鼠用10％水合氮醛(300mg瓜g)腹腔注射麻醉，俯臥固定，皮膚消毒，無菌操作，用低速牙科

2、鉆(夾裝0．2mm厚度鋸片)在股骨中段(大轉(zhuǎn)子下O．5cm)切斷股骨，克氏針?biāo)枨荒嫘泄潭╗8]。假手術(shù)組大鼠不切斷股骨，縫合切口，無菌包扎。動(dòng)物放置籠中，自由活動(dòng)與進(jìn)食。存活率100％。1．2．2干預(yù)j治療：根據(jù)清代趙濂《傷科大成》記載，本院制劑室依據(jù)國中醫(yī)藥發(fā)(2009)3號文件要求，制備壯筋續(xù)骨湯，最終藥液250ml，含生藥1259，濃度0．59／ml。．20。C儲存。根據(jù)前期研究的理想結(jié)果【8】，每日1．259／kg(2．5ml／kg)灌胃，每曰1次，連續(xù)28天。假手術(shù)組和對照組同步給予等量的生理鹽水。1．3評價(jià)指標(biāo)：每

3、組于治療后7、14、21、28天各取6只動(dòng)物，水合氮醛麻醉，進(jìn)行觀察研究。1．3．1X線觀察：X線攝片，觀察骨折愈合情況。1．3．2解剖觀察：完整取出股骨，剔除多余軟組織，照相記錄骨折愈合情況。1．3．3蘇木精．伊紅染色：取出股骨，剔除多余軟組織，生理鹽水洗滌，置4％1拘I多聚甲醛固定24h，蒸餾水浸泡4h，再置于20％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣15d。然后截取骨痂組織，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿股骨縱軸連續(xù)切片，厚59m，貼于載玻片。蘇木精．伊紅(HE)染色觀察骨痂組織結(jié)構(gòu)。1．3．4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELIS

4、A)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4ml，4000rpm離心10min，分離血清，雙抗夾心ELISAkit測定血清GH濃度，以3萬方數(shù)據(jù)青島大學(xué)碩士學(xué)位論文ng／mL表示。1．3．5免疫組化染色：1)切片常規(guī)脫蠟、水化；2)3％H202處理10min，洗滌2min×3次；3)室溫消化8min，水洗5minx3次；4)室溫山羊血清封20min，甩干；5)滴加一抗，37℃孵育2h，PBS洗3min×3次；6)滴加二抗，37℃孵育20min，PBS洗2minx3次；7)SABC，37℃孵育20min，PBS洗5min×4次

5、；8)室溫DAB顯色3-5min，水洗；9)脫水、透明、封片；10)在400倍光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，陰性對照切片以O(shè)．01mol／LPBS替代一抗染色，不出現(xiàn)陽性著色。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)不重疊的視野，Image-ProPlus圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析吸光度值(A)。以陽性細(xì)胞A一背景A表示陽性表達(dá)程度，取其均值。1．3．6抗酒石酸酸性磷酸酶染色【9】：取蓋玻片，esecL戊二醛中4。C固定7min，蒸餾水漂洗3遍。0．125mLGBC溶液和0．125mL亞硝酸鹽溶液，輕輕混勻30S，靜

6、止2min。取先預(yù)熱的11．25mL三蒸水，將第二步制得的混合液加入，并分別依次加入下列物質(zhì)：0．125mL萘酚AS．BI磷酸鹽溶液，0．5mL醋酸溶液，0．25mL酒石酸溶液，制得染色液。將蓋玻片放入染色液中，37。C孵育1h。三蒸水沖洗3遍，光鏡下觀察TRAP染色后，鏡下破骨細(xì)胞呈多核巨細(xì)胞(>3個(gè)細(xì)胞核)計(jì)為破骨細(xì)胞，TRAP陽性表現(xiàn)為酒紅色顆粒。觀察破骨細(xì)胞與GHR分布關(guān)系。1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以x士s表示，采用SPSSl7．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。4萬方數(shù)據(jù)第二章結(jié)果第2章結(jié)果1血清GH水平ELISA結(jié)果顯示n3

7、，術(shù)

8、后7天、14天、21天、28天，假手術(shù)組大鼠血清GH水平未見顯著性變化，P>0．05；模型組和治療組大鼠在術(shù)后第7天、14天、21天也未見顯著性變化，P>0．05，但均顯著高于假手術(shù)組，P<0．05，在第28天則顯著下降，P<0．05。血清GH水平在術(shù)后7天、14天、21天模型組和治療組大鼠之間無顯著差異，P>0．05，但術(shù)后第28天治療組血清GH水平顯著高于假手術(shù)組及對照組，P<0．05。見表1、圖1。表1血清GH含量(平均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差)8與對照組比較，P<0．05；6與假手術(shù)組比較，P<0．05；。與21天比較，P<0．0

9、5圖1血清GH含量(平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差)2骨痂組織GHR表達(dá)強(qiáng)度免疫組化檢測顯示，術(shù)后7天、14天、21天、28天，假手術(shù)組大鼠骨痂組織5萬方數(shù)據(jù)中GHR表達(dá)強(qiáng)度未見顯著性變化，P>O．05；模型組和治療組大鼠在術(shù)后第7天、14天、21天也未見顯著性變化，P>O．05，但均顯著高