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《泛素相關(guān)蛋白dcn1p的原核表達、純化、晶體篩選及相互作用蛋白分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、”#日tnuDGj翌一密§：鹽歪學技t嘲：10712Ⅱ究生學號：sY20¨“"⑩西北農(nóng)林講捉大學2007屆攻讀碩士學位研究生學位(畢業(yè))論文泛素相關(guān)蛋白DcnlP的原核表達、純化、晶體篩選及相互作用蛋白分析學科專業(yè)生物塑堡生研究方向生毖廈星芏研究生揚曉蘊指導教師酆逋五熟撞到塑五班玨縣完成時間2四2至5目中圈陜西餉凌泛素相關(guān)蛋白Denlp的原核表達、純化、晶體篩選及相互作用蛋白分析摘要泛素一蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomepathway，UPP)不僅是一種破壞陳舊或損壞蛋白質(zhì)的重要機制之一，而且還參與調(diào)節(jié)細胞
2、周期進程、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、受體胞吞、抗原呈遞、細胞增生與分化以及信號轉(zhuǎn)導等各種細胞生理過程，uPP的異常與諸多疾病有密切關(guān)系。酵母(S．cereviciae)蛋白Dcnlp參與了UPP途徑中E3復合物SCF的Neddylation作用，并能促進此UPP途徑底物的降解。本研究的內(nèi)容包括：運用基因工程技術(shù)克隆Denlp蛋白基因至表達載體；運用原核表達技術(shù)獲得表達大量可溶性的Denlp全長蛋白；經(jīng)親和層析、FPLC系統(tǒng)O柱及SephadexG．200純化全長蛋白；通過懸滴氣象擴散法篩選蛋白晶體；在獲知結(jié)構(gòu)后，通過親和層析和免疫印跡檢測D
3、cnlp相互作用蛋白；采用表面等離子共振(SPR)進一步確定相互作用并獲得結(jié)合常數(shù)。本研究的結(jié)論包括：1．獲得了大量純度達95％以上的Denlp蛋白；2．Denlp蛋白在100MmTrisHCI(Ph8．5)，30％PEGMME．5000，0．2M硫酸銨條件下獲得了可用于數(shù)據(jù)收集并解析結(jié)構(gòu)的晶體：3．在國內(nèi)外首次獲得Denlp蛋白晶體結(jié)構(gòu)，分辨率為1．9A的晶體結(jié)構(gòu)中包括第66--269位氨基酸殘基的定位，符合正六面體空間排布，共由11個a一螺旋連接而成。4．在國內(nèi)外首次提出并證實Rbxl同Dcnlp有弱相互作用，測得二者平衡結(jié)
4、合常數(shù)KA=3．72x105M～，進一步確定Dcnlp參與UPP以及Neddylation途徑，也為Dcnlp參與構(gòu)成Neddylation途徑中E3復合物的推斷提供了重要的新證據(jù)。本研究在結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上探究Dcnlp的生物學功能，對Neddylation途徑有了更為深入的了解，為泛素途徑E3復合物SCF在細胞周期、有絲分裂中如何發(fā)揮作用提供新的依據(jù)和思路，對泛素途徑相關(guān)的腫瘤、神經(jīng)性疾病及炎癥等疾病的研究具有重要的生物學意義。關(guān)鍵詞：泛素途徑；Dcnlp：原核表達；純化；晶體篩選；RbxlPROKARYOTICEXPRESS
5、ION。PUⅪFICATION，CRYSTALLIZATIONOFDCNlPINPROTEINNEDDYLATIONANDANAL，YSISOFTHEPROTEINSINTERACTEDABSTRACTProteindegradationmediatedbyubiquitin-proteasomepathwayisallimportantmechanismwhichmodulatescellularproteins’activityandfunction．ModifieationofCullinsbyNedd8isimporta
6、ntfortheirubiquitinE3ligaseactivities．Dcnlp，anevolutionarilyconservedprotein，promotesCullinneddylationinvivo，bindsdirectlytoNedd8andassociateswitllCullinlinthebuddingyeastSacchromycescerevisiae．Inthispaper，inordertoknowmoreaboutthefunctionsofDenlp，firstrecombinantful
7、l·lengthyeastDcnlpasaGST-fusionprotein．GST-DcnlpwasexpressedinE．coli．RecombinantWaspurified0naglutathione-agarose(GSH)affinitycolumn,followedbyremovaloftheOST-tagwimthrombindigestion．FurtherpurificationofDcnlpWascarriedontusingsuccessivechromatographystepsonQandSuper
8、dex-200columns．Crystalsweregrownbythehangingdropvapordiffusionmethod．GST-pulldowntechnologyandwesternblottingWasusedtoscreentheprot
