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《蛋白酶高產(chǎn)海洋酵母的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶性質(zhì)的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、⑧研究生學(xué)位論文蛋白酶高產(chǎn)海洋酵母的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶性質(zhì)的研究研究生姓名王蒸指導(dǎo)教師姓名池蘧鰓救援申請(qǐng)學(xué)位撮攢蕊±專業(yè)名稱盎生生紐堂論文答辯日搬鯉生蔓昱鰉丑學(xué)位授予日期巡簍且中國海洋大學(xué)蛋白酶高產(chǎn)海洋酵母的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶性質(zhì)研究摘要本研究從自然界中分離篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的海洋酵母HN311，經(jīng)鑒定屬于類酵母屬短梗霉(Aureobasidiumpullulans)。對(duì)HN311發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究確定其最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分為(％，wlv)：可溶性淀粉2．5，NaN032．0，起始pH6．0；最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件是：25
2、0mL錐形瓶培養(yǎng)基裝量為50mL，10．0％(v／v)的接種量，24℃條件下攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣量為8，培養(yǎng)24h。在最適產(chǎn)酶條件下，培養(yǎng)24h時(shí)菌株HN31l發(fā)酵液中蛋白酶比活力可達(dá)到623．1U／mL。該蛋白酶是一種胞外酶，SephadexG一100凝膠過濾、CM—SepharoseFastFlow陽離子交換層析對(duì)菌株HN311發(fā)酵液中的蛋白酶進(jìn)行了分離提純，獲得了SDS—PAGE呈單條帶的蛋白酶，分子量為33kD，Km和Vmax分別為0654mg／mL、25．64Pmol／min／mL。對(duì)該純酶進(jìn)行部分酶學(xué)性質(zhì)的
3、研究表明該蛋白酶的最適作用溫度和最適反應(yīng)pH分別為45℃和10，酶比活力酶在pH偏中性環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)pH低于6或者pH高于10時(shí)，酶的比活力基本等于零。溫度對(duì)蛋白酶比活力的影響較為明顯，并且隨著時(shí)間的延長，溫度對(duì)蛋白酶的影響更為明顯，50。C以上保溫30min后酶比活力基本完全喪失。金屬離子Mn”對(duì)酶比活力有明顯地促進(jìn)作用，O．OlmmoL／L的Mn”能夠使蛋白酶比活力提高至對(duì)照組酶比活力的近兩倍，10mmol／l的Mn2+可以使蛋白酶的比活力提高到原來的114倍。Mg”、ca2+、和Na+對(duì)蛋白酶比活力的影響都不太明顯，
4、O．01mmol／1的Fe”、Fe”、Zn2+和Cu2+對(duì)蛋白酶比活力的影響不大，但是10mmol／I的Fe3+、Fe”、zn2+4和Cu2+對(duì)酶比活力具有明顯的抑制作用，尤其是Hg”在濃度為n01mmoL／L或者是10mmol／l時(shí)即可使酶基本完全失活。PMSF、SDS對(duì)蛋白酶比活力具有明顯的抑制作用，可使酶基本完全失活，由此可以看出，此蛋白酶是絲氨酸型蛋白酶。關(guān)鍵詞：海洋酵母堿性蛋白酶發(fā)酵最適培養(yǎng)條件純化AbstractAstrainHN3l1withhighproteaseactivitywasisolatedfroms
5、edimentsofsalternnearQingdao，China．ItWaSidentifiedbelongtotheAureobasidiumpullulans．TheoptimalcompositionsofthemediumforHN311strainwerestudiedasfollows(％，w／v)：solublestarch2．5，NaN031．0，theinitialpH6．0．TheoptimalproducingproteaseconditionsforHN311wereillustratedbelow
6、：amountofinoculationl0％(v／v)，incubatingtemperature24。C，shakingcultivation150rpmandaeration8L／min．Theproteaseactivityoffermentedbrothcouldreach623．1U／mLwhenHN31wasincubatedundertheoptimalcultivitionconditions．Theproteaseofthestrainwaspurifiedbygelfiltration(SephadexG
7、一100colum)andion—exchangechromatography(CM—SepharoseFastFlowcolum)，SDS—PAGEshowedasinglebandforthepurifiedproteaseandthemolecularweightwasestimatedtobe33kD，Km=0654mg／mLandVmax=2564¨nol／min／mL。TheoptimaltemperatureandpHforhydrolysisoftheproteasewere45。Cand10，respecti
8、vely．ThechangesofpHandtemperaturehadthesignificantinfluencesontheproteaseactivity．Mn2+ionenhancedtheenzymeactivitysignificantly．10mmol／lor
