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1、海洋微藻多糖提取純化條件的研究吳 曼,李文權(quán),張賽金,陳清花(廈門(mén)大學(xué)海洋學(xué)系、亞熱帶海洋研究所,福建廈門(mén) 361005)摘 要:研究了提取介質(zhì)、超聲條件和洗脫條件對(duì)海洋微藻多糖提取純化效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同pH的提取介質(zhì)可以提取得到不同種類(lèi)的多糖,超聲條件以300W、20min最佳,用葡聚糖凝膠Sephadex-G200柱(長(zhǎng)50cm,直徑2cm)純化粗多糖,當(dāng)加樣量為4ml,用0.2mol/LNaCl溶液洗脫效果最好。關(guān)鍵詞:海洋微藻;多糖;提取純化 海洋微藻富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、多糖和維生素等生物活性物質(zhì)。海洋微藻多糖不同于陸生高等植物多糖,其中硫酸多糖具有獨(dú)特的化學(xué)
2、結(jié)構(gòu)和藥用價(jià)值。例如螺旋藻多糖雖然僅占微藻干重的10%[1],但由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有獨(dú)特的藥用價(jià)值。Hayashi[2-4]等用熱水從螺旋藻中提取一種新型硫酸多糖(Ca-SP),具有顯著的抗病毒活性。因此,加快海洋微藻生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)可以彌補(bǔ)陸地植物及大型海藻藥用特性的不足。目前對(duì)海洋微藻多糖的研究遠(yuǎn)不及陸地植物和大型藻類(lèi)多,國(guó)內(nèi)此類(lèi)研究報(bào)道極少。本文以海水小球藻(MarineChlorella)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)為研究對(duì)象,研究了海洋微藻多糖的提取、分離純化條件,建立了海洋微藻多糖提取純化的最優(yōu)方法,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和開(kāi)展海洋微藻多糖研究提供了實(shí)驗(yàn)基
3、礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料海水小球藻藻種引自廈門(mén)大學(xué)生物系,球等鞭金藻藻種引自廈門(mén)大學(xué)海洋生物實(shí)驗(yàn)室,按F/2配方在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光暗周期為12h/12h,取指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液離心過(guò)濾,60℃烘干,研磨成粉末。1.2 主要儀器和試劑無(wú)水乙醇、蒽酮、三氯乙酸、丙酮均為分析純?cè)噭?葡聚糖凝膠Sephadex-G200為生化試劑,凝膠柱長(zhǎng)50cm,直徑2cm。主要儀器為VCX600型超聲波細(xì)胞破碎儀(S&MInc,USA)和LD4-2離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。1.3 多糖提取純化工藝流程干藻粉稱(chēng)重,加入提取介質(zhì)后超聲破碎,于80℃水浴提取1h。離心取上清液,3倍體積無(wú)水乙醇沉淀,加3%
4、三氯乙酸溶解沉淀,再用3倍體積無(wú)水乙醇沉淀。丙酮洗滌沉淀,烘干沉淀得到粗多糖。粗多糖經(jīng)Sephadex-G200柱層析,洗脫后獲精多糖。碳水化合物含量用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定[5]。2 結(jié)果和討論2.1 不同提取介質(zhì)對(duì)多糖提取的影響分別采用4%NaOH、蒸餾水和鹽酸(pH=3)作為介質(zhì)對(duì)海水小球藻提取和分離純化。不同提取介質(zhì)對(duì)海水小球藻多糖提取率的影響見(jiàn)表1。超聲條件為功率450W,超聲時(shí)間20min,脈沖9.9s、間隔3.3s。柱層析純化條件是加樣量3ml,以0.2mol/LNaCl溶液為洗脫液。由表1可知,超聲破碎協(xié)同稀堿法的粗多糖提取率遠(yuǎn)大于相同超聲條件下的蒸餾水法和鹽酸法,但稀堿法
5、得到的粗多糖經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離純化后,精多糖提取率有明顯的降低,表明稀堿法提取多糖容易引入雜質(zhì)。比較3種介質(zhì)條件下提取的精多糖含量可知,超聲協(xié)同蒸餾水法相對(duì)提取率較高,得到的粗多糖的雜質(zhì)含量較低。不同提取介質(zhì)下所得粗多糖經(jīng)Sephadex-G200柱純化,洗脫曲線見(jiàn)圖1、2、3。由圖可知,用稀堿提取可得到兩種精多糖分別為ADT1和ADT2,而水提和酸提都只得到一種精多糖,分別命名為WDT和HDT。經(jīng)氣相色譜和紅外光譜分析可知,ADT1和ADT2都是均多糖。ADT1由葡萄糖組成,ADT2由半乳糖組成,并且均含有乙酰氨基,但都不含硫酸基。WDT和HDT均為雜多糖,WDT由鼠李糖、核糖、阿拉伯
6、糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7種單糖組成,HDT由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6種單糖組成,都含有乙酰氨基和硫酸基。這說(shuō)明不同的提取介質(zhì)可以提取得到不同種類(lèi)的多糖,這與Ray[6]提出的在同一種溶劑作用下多糖很難被完全提取的結(jié)論相符?！”? 不同提取介質(zhì)下海水小球藻多糖的提取率介質(zhì)4%NaOH蒸餾水鹽酸(pH=3)粗多糖/干藻重(%)25.204.241.87精多糖/干藻重(%)2.573.121.32精多糖/粗多糖(%)10.273.670.62.2 超聲條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)海洋微藻多糖主要存在于藻類(lèi)細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中,采用超聲破碎方法破碎細(xì)胞,可以提高多糖提取率。超聲破碎
7、由3個(gè)條件需要設(shè)定,即超聲功率、超聲時(shí)間和超聲作用方式(脈沖)。本實(shí)驗(yàn)固定脈沖時(shí)間9.9s,間隔3.3s,改變超聲功率和超聲時(shí)間,研究它們對(duì)海洋微藻中多糖提取率的影響。2.2.1超聲功率對(duì)海洋微藻多糖提取的影響在超聲脈沖9.9s、間隔3.3s,超聲時(shí)間20min的條件下,改變超聲功率為0W、150W、300W、450W、480W,蒸餾水體積70ml,按1.3流程提取海水小球藻中的多糖,結(jié)果見(jiàn)表2。表2 不同超聲功率對(duì)海水小球藻多糖提
